鉤藤生物堿逆轉腫瘤多藥耐藥活性及機制研究.pdf

1、腫瘤多藥耐藥（multi-drug resistance,MDR）成為腫瘤化療失敗的重要原因，而ATP結合盒（ATP binding cassette,ABC）轉運家族蛋白的高表達引起的藥物外排增加是導致腫瘤MDR的主要原因之一，因此，研發(fā)針對ABC轉運蛋白介導的多藥耐藥逆轉劑成為克服腫瘤MDR的有效手段。然而，目前針對ABC轉運家族蛋白的三代逆轉劑由于其專屬性低、毒性大以及體內親和力小等原因均未能成功上市。近年來，從中藥中篩選出高效低

2、毒的耐藥逆轉劑及先導化合物已經(jīng)成為腫瘤MDR研究的熱點。
　　鉤藤生物堿是從臨床常用中藥鉤藤中分離得到的生物堿類成分，其中鉤藤堿（Rhynchophylline,Rhy）、異鉤藤堿（Isorhynchophylline,Irhy）、去氫鉤藤堿（Corynoxeine,Cory）和異去氫鉤藤堿（Isocorynoxeine,Icory）是鉤藤氧化類吲哚生物堿中的主要單體成分，而毛鉤藤堿（Hirsutine,HT）和去氫毛鉤藤堿（Hi

3、rsuteine,HST）是鉤藤非氧化類吲哚生物堿中的主要單體成分。有研究報道鉤藤生物堿提取物及其單體成分具有抑制多種腫瘤細胞增殖以及促進腫瘤細胞凋亡等活性，但在鉤藤生物堿逆轉腫瘤多藥耐藥方面的報道甚少。本研究發(fā)現(xiàn)以氧化吲哚生物堿為主的鉤藤生物堿提取物（U1）和以非氧化吲哚生物堿為主的鉤藤生物堿提取物（U2）及其六個單體成分均具有逆轉腫瘤多藥耐藥活性，并選取毒性較小且逆轉活性最佳的異去氫鉤藤堿（Icory）為主要研究對象，對鉤藤生物堿逆

4、轉腫瘤多藥耐藥機制進行深入研究。
　　目的：對鉤藤生物堿逆轉腫瘤多藥耐藥活性進行評價，篩選出活性較好的單體成分Icory為主要研究對象，進行進一步的耐藥活性評價，并對其作用機制做深入研究，以期為將鉤藤生物堿開發(fā)成為腫瘤多藥耐藥逆轉劑或先導化合物提供科學依據(jù)。
　　方法：
　　1.對鉤藤生物堿逆轉腫瘤多藥耐藥活性的評價：
　?。?）采用MTT法分別確定U1、U2、Rhy、Irhy、Cory、Icory、HT和HST

5、在HepG2細胞和HepG2/ADM細胞上的非毒劑量；
　?。?）采用MTT法對U1、U2和六個單體化合物進行腫瘤多藥耐藥逆轉活性的初步評價，并篩選出逆轉活性最佳的鉤藤生物堿單體成分；
　　（3）采用MTT法在ABCB1高表達細胞株及其敏感細胞株上進一步對Icory的逆轉活性進行評價；
　　（4）采用MTT法分別在ABCC1和ABCG2高表達的細胞株及其敏感細胞株上對Icory的逆轉活性進行評價；
　　2.對鉤藤

6、生物堿逆轉腫瘤多藥耐藥機制的研究：
　?。?）通過熒光酶標儀及熒光拍照檢測Icory對多柔比星（Doxorubicin,DOX）在耐藥細胞內累積的影響；
　?。?）通過熒光酶標儀檢測Icory對耐藥細胞外排DOX的影響；
　　（3）采用qPCR和Western Blot法檢測Icory對ABCB1在mRNA和蛋白表達的影響；
　?。?）通過Pgp-GloTM ATPase試劑盒檢測Icory對ABCB1 ATPa

7、se活性的影響；
　?。?）運用MTT法檢測Icory耐藥逆轉活性的持續(xù)性；
　?。?）采用Docking分子對接的方法預測分析Icory和ABCB1的結合方式和結合位點。
　　結果：
　　1.U1、U2、Rhy、Irhy、Cory、Icory、HT和HST均具有逆轉腫瘤多藥耐藥活性，其中Icory的逆轉作用最強；
　　2.Icory能夠增加HepG2/ADM和MCF-7/ADR等ABCB1高表達細胞對DO

8、X，長春新堿（Vincristine, VCR）和紫杉醇（Paclitaxel）等ABCB1底物的抗腫瘤藥物的敏感性，但不增加ABCB1高表達細胞株對非ABCB1底物順鉑（Cisplatin）的敏感性；
　　3.Icory不能增加ABCC1高表達細胞株HEK293/MRP1和ABCG2高表達細胞株S1-M1-80對抗腫瘤藥物的敏感性；
　　4.Icory能夠增加DOX在HepG2/ADM和MCF-7/ADR細胞內的累積；

9、r>　　5.Icory能夠抑制HepG2/ADM細胞對DOX的外排作用；
　　6.Icory對ABCB1的表達量無明顯影響；
　　7.Icory能夠刺激ABCB1 ATPase的活性；
　　8.Icory的逆轉作用依賴于其濃度，不具有持續(xù)性；
　　9.Icory占據(jù)ABCB1底物的重要結合位點，且和VRP與ABCB1的結合位點部分重疊。
　　結論：鉤藤生物堿具有逆轉腫瘤多藥耐藥活性，Icory能夠特異性逆轉