microRNA10b在HGF誘導的MSCs定向遷移中的作用.pdf

1、間充質干細胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)是存在于骨髓、脂肪、肌肉等多種組織的成體干細胞，因其具有來源廣泛，易于體外擴增，無免疫原性等優(yōu)點近年來被廣泛地應用于治療心肌缺血，骨發(fā)育不全，骨折，腦損傷等一些疾病中。MSCs具有多向分化潛能，其不僅可以分化為中胚層來源細胞例如成骨細胞、成脂細胞、軟骨細胞，而且還可以誘導分化成外胚層來源的神經(jīng)細胞，具有神經(jīng)細胞的形態(tài)，并且表達神經(jīng)元特異性的標志。有研究表

2、明MSCs可以定向遷移到損傷組織、慢性炎癥部位及腫瘤部位，因此成為代替神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)治療惡性膠質瘤等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的理想載體。MSCs在體內(nèi)定向遷移到受損組織的具體機制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)MSCs因其表達特定類型的趨化因子受體，能夠應答腫瘤區(qū)域所產(chǎn)生的特定趨化因子，從而引發(fā)MSCs定向遷移行為。MSCs表達HGF受體c-met，并且在體外HGF能明顯促進MSCs的遷移。在惡性膠質瘤分泌的很多細胞

3、因子中，NSCs對HGF的趨化性應答最強。
　　 microRNA是一段由20-25nt組成的非編碼RNA，通過其5＇末端6-8個堿基的seed區(qū)域與多個mRNA的3＇UTR區(qū)不完全配對來影響mRNA的翻譯與穩(wěn)定性，在基因表達的轉錄后水平上起著重要的調節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)干細胞決定與行為受到很多microRNA的調控，并且在不同類型細胞中均發(fā)現(xiàn)調控其遷移行為的microRNA分子。microRNA17/20, microRNA10b

4、, miRNA151, microRNA-146b和microRNA23同過靶向不同基因的mRNA影響腫瘤細胞遷移，microRNA9，microRNA124在神經(jīng)細胞中表達，影響神經(jīng)細胞的發(fā)育及遷移，microRNA145在維持胚胎干細胞自我更新與分化間的平衡及腫瘤細胞的侵襲中發(fā)揮重要作用。以上結果表明，這些與遷移相關的microRNA分子可能在HGF誘導的MSCs定向遷移過程中發(fā)揮重要作用。
　　 本研究首先利用MiniOp

5、ticon real-time PCR檢測經(jīng)5ng/mlHGF刺激30min，與未刺激組MSCs中九種與遷移相關microRNA的差異表達情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)因子刺激后MSCs中microRNA145，microRNA17-5p, microRNA-181，microRNA9的表達量顯著上調，而microRNA10b，microRNA124及microRNA146表達量顯著下調。因microRNA10b通過靶基因Tiam1和HoxD10分別影響

6、下游Rac1及RhoC的活性，與細胞遷移有密切的聯(lián)系。故本研究將microRNA10b作為研究對象，進一步檢測分別改變micoRNA10b與下游分子Rac1的表達對HGF誘導的MSCs定向遷移的影響。
　　 為了研究改變microRNA10b表達對HGF誘導MSCs定向遷移的影響，我們使用Dunn chamber裝置和延時動態(tài)視頻(time-lapsevideo)跟蹤拍攝，分別檢測轉染microRNA10b表達載體及抑制子的MS

7、Cs在HGF刺激下的具體遷移指標，包括細胞的遷移速率和遷移效率。結果發(fā)現(xiàn)高表達microRNA10b后，HGF誘導MSCs的定向遷移速率沒有明顯變化，遷移效率顯著下調；抑制microRNA10b后，HGF誘導MSCs的定向遷移速率和遷移效率均顯著上調。
　　 Rac1作為microRNA10b下游信號分子通過調節(jié)肌動蛋白骨架的重排、粘著斑的周轉及細胞片狀偽足的伸展調控細胞鋪展、細胞極性與細胞遷移。為了更好地研究Rac1對MSCs

8、定向遷移的影響，我們構建了Rac1及其突變體Rac1Q61L、Rac1G12V、Rac1T17N腺病毒表達載體，并制備出病毒，檢測病毒滴度為107 pfu/ml后感染MSCs，經(jīng)篩選發(fā)現(xiàn)150MOI為最適MSCs的病毒感染復數(shù)。
　　 最后我們利用Dunn chamber裝置，檢測經(jīng)腺病毒Ad，Ad-Rac1，Ad-Rac1Q61L，Ad-Rac1G12V, Ad-Rac1T17N感染的MSCs趨向HGF的個體性遷移指標，包括遷

9、移速率和遷移效率。發(fā)現(xiàn)高表達Rac1即感染Ad-Rac1Q61L的MSCs遷移速率顯著上升，遷移效率沒有明顯變化；高表達野生型Rac1即感染Ad-Rac1的MSCs遷移效率和遷移速率均無明顯變化；降低阻斷Rac1活性即感染Ad-Rac1T17N的MSCs遷移遷移效率和遷移速率均顯著降低。利用Boyden chamber檢測感染Rac1及突變體后MSCs的群體性遷移行為，發(fā)現(xiàn)高表達活性Rac1與野生型Rac1能明顯促進細胞群體性遷移，阻斷

10、Rac1活性則會明顯抑制MSCs群體性遷移。
　　 以上結果表明，改變microRNA10b及下游分子Rac1的表達均能影響HGF誘導的MSCs的定向遷移行為，下一步實驗將繼續(xù)研究利用實時定量PCR檢測出的其他具有顯著差異表達microRNA（如microRNA124，microRNA9等）的功能，以期找到多條microRNA通路間的聯(lián)系，為進一步揭示調控MSCs定向遷移的分子機制及臨床應用MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供理論依據(jù)。