基質(zhì)硬度及細(xì)胞力學(xué)特性在椎間盤退變中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)椎間盤軟骨終板細(xì)胞鈣化及其機(jī)制研究
　　目的:椎間盤退變引發(fā)多種脊柱疾病，然而其發(fā)病機(jī)制并不完全清楚。軟骨終板鈣化是椎間盤退變的使動和促進(jìn)因素。椎間盤力學(xué)環(huán)境對于椎間盤退變具有重要作用。然而，基質(zhì)硬度的改變對于軟骨終板鈣化的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制目前并不清楚。
　　方法:本實(shí)驗(yàn)首先采用原子力顯微鏡測定不同退變程度軟骨終板的基質(zhì)硬度。并利用聚丙烯酰氨凝膠模擬不同退變軟骨終板硬度，研究基質(zhì)硬度對軟骨終板細(xì)胞行為及

2、促進(jìn)鈣化的影響。進(jìn)一步，我們利用miRNA-mRNA共表達(dá)分析研究miR-20a高硬度促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞鈣化中的分子機(jī)制。利用雙熒光素酶報告基因證實(shí)miR-20a可以直接靶向ANKH。之后，利用過表達(dá)/敲低miR-20a、慢病毒過表達(dá)ANKH等手段明確miR-20a/ANKH軸在高硬度促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞鈣化中的關(guān)鍵作用。
　　結(jié)果:在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)軟骨終板基質(zhì)硬度與椎間盤退變等級呈正相關(guān)，高硬度（模擬嚴(yán)重退變時的軟骨終板基質(zhì)硬度）

3、促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞鈣化。進(jìn)一步，我們通過miRNA-mRNA共表達(dá)分析隨著硬度增加上調(diào)miR-20a表達(dá)，同時下調(diào)ANKH表達(dá)。通過雙熒光素酶報告基因證實(shí)miR-20a直接靶向ANKH3'-UTR，從而抑制ANKH表達(dá)。在高硬度基質(zhì)上，抑制miR-20a可以顯著降低鈣沉積和鈣化相關(guān)基因表達(dá)，而過表達(dá)miR-20a可以促進(jìn)鈣化形成。在高硬度基質(zhì)上，利用慢病毒過表達(dá)ANKH后可以上調(diào)焦磷酸含量同時抑制鈣結(jié)節(jié)的形成。進(jìn)一步驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)，我們收集

4、了不同退變程度的病人軟骨終板組織，證實(shí)隨著軟骨終板的退變，其ANKH表達(dá)量下降。
　　結(jié)論:在本實(shí)驗(yàn)中，我們證實(shí)了miR-20a/ANKH軸在高硬度基質(zhì)促進(jìn)軟骨終板細(xì)胞鈣化中的重要作用，提示miR-20a和ANKH可能作為未來治療椎間盤退變的重要靶點(diǎn)。
　　第二部分、髓核祖細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)與分化能力相關(guān)性研究
　　目的:細(xì)胞力學(xué)特性可以反映出不同的細(xì)胞亞群、疾病狀態(tài)和組織來源等重要的細(xì)胞生化表型信息。過去的研究已經(jīng)證實(shí)椎間

5、盤蛻變可以導(dǎo)致細(xì)胞行為和分化能力的改變。髓核祖細(xì)胞具有多向分化能力，可以用作治療椎間盤退變的種子細(xì)胞。然而，對于髓核祖細(xì)胞分化能力和細(xì)胞力學(xué)特性之間的關(guān)系目前還不清楚，這也阻礙了髓核祖細(xì)胞進(jìn)一步的應(yīng)用。
　　方法:本部分實(shí)驗(yàn)中，利用原子力顯微鏡測定不同單克隆亞群的祖細(xì)胞力學(xué)特性（彈性模量、松弛模量、瞬時模量和）。并利用三系誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（成骨分化、成軟骨分化和成脂分化）對各個單細(xì)胞髓核祖細(xì)胞克隆群進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對

6、髓核祖細(xì)胞力學(xué)特性與其分化能力進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　結(jié)果:我們發(fā)現(xiàn)髓核祖細(xì)胞的彈性模量、松弛模量和瞬時模量與其成骨分化能力成正相關(guān)，髓核祖細(xì)胞的表觀粘度與其成軟骨分化能力成正相關(guān)。
　　結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明髓核祖細(xì)胞的力學(xué)特性對預(yù)測其分化能力，篩選不同祖細(xì)胞亞群具有重要作用。提示生物力學(xué)特性可被用作篩選干細(xì)胞的“Biomarker”，為后續(xù)椎間盤組織工程中種子細(xì)胞的篩選提供了一種基于細(xì)胞力學(xué)的方法，可為椎間盤退變的治療提供分

7、化能力更強(qiáng)的種子細(xì)胞亞群。
　　第三部分、間充質(zhì)干細(xì)胞通過SDF-1/CXCR4/AKT通路調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)
　　目的:前期研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療椎間盤退變在緩解和抑制椎間盤退變的病理生理過程中具有顯著作用。細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)在調(diào)節(jié)細(xì)胞-基質(zhì)相互作用中具有非常重要的作用，尤其是在反應(yīng)細(xì)胞表型和細(xì)胞行為中特異性的改變具有重要價值。然而在間充質(zhì)干細(xì)胞和髓核細(xì)胞共培養(yǎng)中對髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)的影響目前還不清楚。
　　方法:實(shí)

8、驗(yàn)中使用共培養(yǎng)體系，重點(diǎn)研究髓核細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)。利用原子力顯微鏡對髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)，包括彈性模量、松弛模量和瞬時模量等進(jìn)行精確測定。同時利用化學(xué)阻斷劑或siRNA技術(shù)研究相關(guān)的信號通路。在測定髓核細(xì)胞生物學(xué)活性中，主要考慮了細(xì)胞增殖和基質(zhì)基因表達(dá)情況的分析。
　　結(jié)果:在本實(shí)驗(yàn)中，我們證明了共培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和退變髓核細(xì)胞將導(dǎo)致退變髓核細(xì)胞的力學(xué)性質(zhì)（彈性模量、松弛模量和瞬時模量）顯著降低，同時退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)活性上調(diào)，但共培

9、養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞和正常髓核細(xì)胞，不能觀察到此現(xiàn)象。在共培養(yǎng)退變髓核細(xì)胞后，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的SDF-1顯著增加。利用藥物抑制劑AMD3100抑制SDF-1或siRNA敲低CXCR4表達(dá)水平后，共培養(yǎng)MSCs使退變髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)降低，生物學(xué)活性上升的現(xiàn)象被抑制，提示SDF-1/CXCR4通路在間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)節(jié)髓核細(xì)胞力學(xué)性質(zhì)中具有重要作用。進(jìn)一步，我們發(fā)現(xiàn)阻斷AKT和FAK可以顯著減低間充質(zhì)干細(xì)胞或SDF-1重組蛋白誘導(dǎo)的退變髓核細(xì)胞力學(xué)