β-catenin基因?qū)顾柙葱陨窠?jīng)干細(xì)胞增殖及分化作用的研究.pdf

1、目的：
　　從CD1胎鼠脊髓中提取神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells,NSCs）并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定，探討β-catenin基因?qū)顾柙葱陨窠?jīng)干細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步體內(nèi)試驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　將E14的CD1孕鼠麻醉后取出胎鼠，無(wú)菌條件下分離胎鼠脊髓組織，單細(xì)胞克隆技術(shù)及干細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定；實(shí)驗(yàn)分為三組：Blank組（無(wú)外加條件培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞），

2、GFP組（感染Ad-GFP腺病毒的神經(jīng)干細(xì)胞），β-catenin組（感染Ad-β-catenin腺病毒的神經(jīng)干細(xì)胞），感染病毒時(shí)間均為5d。光學(xué)顯微鏡觀察三組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)，熒光顯微鏡觀察病毒的感染效率，流式細(xì)胞技術(shù)對(duì)感染效率進(jìn)行驗(yàn)證，Western blot檢測(cè)三組細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)情況；CCK8檢測(cè)和結(jié)晶紫染色法檢測(cè)三組細(xì)胞的數(shù)量，臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)β-catenin作用于NSCs后細(xì)胞的存活率；RT-PCR檢測(cè)三組細(xì)胞

3、的神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的mRNA表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞核（NeuN）、GFAP的表達(dá)及定位；Western blot檢測(cè)NeuN、GFAP的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　胎鼠脊髓組織中分離出的細(xì)胞具有極強(qiáng)的克隆能力，可以形成細(xì)胞團(tuán)，機(jī)械分離后細(xì)胞貼壁，呈不規(guī)則球形，免疫熒光結(jié)果提示早期分離的大部分細(xì)胞Nestin抗原呈陽(yáng)性；感染Ad-β-catenin腺病毒5d后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化

4、，其突觸增長(zhǎng)，細(xì)胞變小，突觸之間連接增多，細(xì)胞折光性增強(qiáng)；熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞技術(shù)結(jié)果顯示感染病毒3d時(shí)細(xì)胞的病毒感染率在50％左右，5d時(shí)感染率在80%左右，Western blot結(jié)果證實(shí)感染5d時(shí)β-catenin組的β-catenin蛋白表達(dá)明顯高于其他兩組（P＜0.05）；CCK8及結(jié)晶紫染色結(jié)果示β-catenin組的細(xì)胞數(shù)量明顯高于Blank組及GFP組（P＜0.05），臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)發(fā)現(xiàn)β-catenin組的細(xì)胞存活

5、率也明顯高于其他兩組（P＜0.05）；PCR結(jié)果顯性神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物NSE的mRNA在β-catenin組顯著高于Blank組及GFP組，而膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP的mRNA表達(dá)均低于其他兩組（P＜0.05）；免疫熒光結(jié)果顯示β-catenin組NeuN蛋白的表達(dá)顯著高于其余兩組（P＜0.05），主要定位于細(xì)胞核中，GFAP的表達(dá)相對(duì)較低（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示β-catenin組的NeuN蛋白表達(dá)顯著高于Blan