腫瘤相關成纖維細胞促進上皮性卵巢癌細胞順鉑耐藥的機制研究.pdf

1、目的：卵巢癌的鉑類耐藥是造成腫瘤復發(fā)和死亡率居高不下的重要原因。腫瘤微環(huán)境與腫瘤的耐藥性密切相關，而腫瘤相關成纖維細胞（Cancer-associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的細胞，本課題擬從卵巢癌組織中分離并鑒定CAFs，深入探討CAFs與上皮性卵巢癌細胞順鉑耐藥的關系及其分子機制，為逆轉卵巢癌細胞的順鉑耐藥提供新的思路。
　　方法：通過組織塊爬行法和酶消化法從卵巢癌組織中提取CAFs，利用

2、免疫熒光技術檢測CAFs中間質(zhì)細胞標志物vimentin和CAFs的特異性標志物α-SMA的表達情況；利用Western blot技術檢測CAFs中上皮細胞標志物CK-8的表達水平。收集CAFs的培養(yǎng)上清（CAFs-CM），與新鮮培養(yǎng)基以1:1或2:1的比例混合制備共培養(yǎng)的混合培養(yǎng)基（Mix1:1和Mix2:1）；利用CCK-8技術檢測在正常培養(yǎng)基（Normal）、Mix1:1和Mix2:1培養(yǎng)條件下上皮性卵巢癌細胞A2780和ES2中

3、順鉑的半數(shù)抑制濃度（IC50值）；運用流式細胞技術檢測細胞在以上三種培養(yǎng)條件下順鉑誘導的細胞凋亡率；利用Western blot技術檢測細胞在以上培養(yǎng)條件下凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3及其剪切體cleaved caspase-3的水平、抗凋亡蛋白Bcl-2和Survivin的表達及二者的上游調(diào)控者STAT3的磷酸化(p-STAT3)水平。加入STAT3的抑制劑Cryptotanshinone驗證Cryptotanshinone能否逆轉

4、CAFs-CM培養(yǎng)條件下的A2780和ES2細胞對順鉑的耐藥性、順鉑誘導的凋亡率及抗凋亡蛋白 Bcl-2、Survivin及 p-STAT3的表達。
　　結果：從卵巢癌組織中提取的CAF s高表達間質(zhì)細胞標志物 vimenti n和CAFs的特異性標志物α-SM A，而上皮細胞標志物 CK-8陰性；CAFs-C M使得A2780和 ES2細胞對順鉑的IC50值逐漸增高（P<0.05），且增高程度與 CAFs-CM的濃度成正比,提示

5、 CAFs-CM促進卵巢癌細胞耐藥并呈濃度依賴性；進一步的研究發(fā)現(xiàn) CAFs-CM抑制順鉑誘導的細胞凋亡（P<0.05），細胞在正常培養(yǎng)基（Normal）、混合培養(yǎng)基 Mix1:1和 Mix2:1中的凋亡率分別為：A2780細胞中Normal組20.02±1.69％； Mix1:1組9.19±0.72%； Mix2:1組3.27±0.75%；ES2細胞中 Normal組21.73±1.62%；Mix1:1組13±1.56%；Mix2:1

6、組6.47±0.67%；可以看出CAFs-CM抑制細胞凋亡也呈CAFs-CM濃度依賴性。同時，CAFs-CM抑制凋亡執(zhí)行蛋白 caspase-3的活化，促進抗凋亡蛋白 Bcl-2、Survivin及p-STAT3的表達（P<0.05）。加入STAT3抑制劑Cryptotanshinone逆轉了 CAFs-CM培養(yǎng)下的細胞對順鉑產(chǎn)生的耐藥性（P<0.05），同時Cryptotanshinone可以促進順鉑誘導的細胞凋亡（P<0.05），抑