mir-373在食管鱗狀細胞癌中的功能及作用機制研究.pdf

1、食管癌(esophageal carcinoma，EC)是全球第八大惡性腫瘤，死亡率高，5年生存率不到15％。在我國，食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)是最常見的病理類型，具有易復發(fā)和轉移等特點。近年來大量研究表明，miR-373在多種惡性腫瘤中均發(fā)揮了重要作用。Voorhoeve等人于2006年第一次提出miR-373,作為一個新的癌基因，它在睪丸精原細胞瘤中通過阻斷p53

2、通路來參與腫瘤的進展。它也可以通過作用于靶基因PPP6C調節(jié)細胞周期，來促進肝癌細胞的生長。而在乳腺癌中，通過監(jiān)測循環(huán)血中miR-373的表達含量可以了解是否發(fā)生淋巴結轉移。另外，miR-373通過作用于Rab22a來抑制人卵巢癌的侵襲和轉移，從而發(fā)揮了抑癌基因的作用?；蛐酒夹g分析，miR-373在ESCC組織中表達上調，比正常組織至少高1.5倍。然而，miR-373在ESCC中的作用機制目前尚不清楚，尤其在血漿中的表達水平及意義目

3、前尚無研究。
　　基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)是一系列能夠降解細胞外基質的蛋白水解酶，通過破壞瘤細胞周圍的組織學屏障，促進惡性腫瘤細胞的浸潤及轉移。MMPs與基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMPs)在正常人體內環(huán)境中處于平衡狀態(tài)，由于腫瘤的特性，使兩者之間的平衡被打破，從而提高了腫瘤侵襲及轉移的能力。其中基質金屬蛋

4、白酶抑制劑-3(tissue inhibitor of metalloproteinase-3,TIMP3)與惡性腫瘤的關系密切，作為一種抑癌基因，TIMP3的低表達可以促進腫瘤的生長、侵襲和轉移，還能抑制細胞凋亡。另外，通過檢測TIMP3在膀胱癌及ESCC中的表達水平，還可以推測患者的預后。在以往的研究中，發(fā)現(xiàn)TIMP3與ESCC的遷移及侵襲能力密切相關，而通過生物信息學軟件的預測，我們也發(fā)現(xiàn)TIMP3可能為miR-373的靶基因。<

5、br>　　在本項研究中，我們檢測了miR-373在ESCC組織及血漿中的表達水平，并通過細胞轉染技術使miR-373的表達上調或下調，觀察miR-373對ESCC細胞增殖、凋亡、細胞遷移及侵襲能力的影響。尋找miR-373的直接靶基因，探討miR-373在ESCC發(fā)病過程中的作用機制，為ESCC的診斷及治療提供了新的理論依據(jù)。
　　第一部分 miR-373在食管鱗狀細胞癌中的表達水平及臨床意義
　　目的:
　　測定mi

6、R-373在ESCC組織及術前血漿中的表達水平，分析miR-373的異常表達與ESCC的分化程度、T分期、淋巴結轉移及TNM分期等臨床特征的關系，探討miR-373在組織及血漿中表達水平的相關性。
　　方法:
　　從2012年10月到2014年9月在山東省腫瘤醫(yī)院及泰安市中心醫(yī)院首次診斷為ESCC患者中選取63名，收集腫瘤組織、瘤旁正常組織及術前外周血，另取39例健康志愿者的外周血作為陰性對照組。采用實時熒光定量PCR技術測

7、定miR-373在ESCC腫瘤組織及瘤旁正常組織中的表達水平，同時檢測了miR-373在術前ESCC患者及健康志愿者血漿中的表達水平。
　　結果:
　　1.miR-373在63例ESCC腫瘤組織中的表達水平要顯著高于瘤旁正常組織(P＜0.01)。miR-373在組織中的表達水平與分化程度、腫瘤T分期及淋巴結轉移密切相關(P＜0.05)。
　　2.miR-373在63例ESCC術前血漿中的表達水平要顯著高于39例健康志愿

8、者(P＜0.01)。miR-373在血漿中的表達水平與腫瘤T分期及淋巴結轉移密切相關(P＜0.05)。
　　3.Spearman相關性檢驗分析得知，miR-373在腫瘤組織中的表達水平與血漿中的表達水平呈正相關(r=0.553,P＜0.01)。說明miR-373在組織及血漿中的表達水平具有一致性。
　　結論:
　　miR-373在ESCC組織及外周血漿中的表達均顯著升高，表明miR-373作為癌基因在ESCC的發(fā)病過程

9、中發(fā)揮了重要作用。
　　第二部分 miR-373對食管鱗癌細胞株生物學行為的影響
　　目的:
　　觀察miR-373表達水平的變化對ESCC細胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力等生物學行為的影響，探討miR-373的表達與ESCC生物學特性的關系。
　　方法:
　　實時熒光定量PCR技術檢測4種ESCC細胞系中miR-373的表達水平。選取miR-373表達水平最高的KYSE410和表達水平最低的ECA109來進

10、行功能實驗。將miR-373 mimics轉染到ECA109細胞中來提高miR-373的表達水平，將miR-373 inhibitor轉染到KYSE410細胞中來降低miR-373的表達水平。通過CCK-8實驗來評估ESCC細胞的增殖能力，凋亡檢測試劑盒測定細胞凋亡的變化，應用未覆蓋及覆蓋Matrigel膠的Transwell小室分別來進行細胞遷移及侵襲實驗。
　　結果:
　　1.miR-373表達水平的次序為KYSE410

11、＞EC9706＞TE-1＞ECA109。選取miR-373表達水平最高的KYSE410和表達水平最低的ECA109來進行功能實驗。
　　2.在ECA109細胞中，轉染48h后，miR-373 mimics組的細胞增殖能力要高于陰性對照組(P＜0.05);而轉染72h后，兩者之間的區(qū)別更加明顯(P＜0.01)。在KYSE410細胞中，轉染48h后，miR-373 inhibitor組的細胞增殖能力低于陰性對照組(P＜0.05);轉染

12、72h后，兩者之間的差異仍具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。這些結果顯示，miR-373可以提高ESCC細胞的增殖能力。
　　3.miR-373 mimics組凋亡細胞所占的比例與陰性對照組相比，無顯著區(qū)別(P＞0.05)。而miR-373 inhibitor組凋亡細胞的比例要高于陰性對照組(P＜0.01)。因此，抑制miR-373的表達可以促進ESCC的細胞凋亡。
　　4.轉染miR-373mimics后ECA109的遷移能

13、力及侵襲能力較陰性對照組顯著提高(P＜0.01)。轉染miR-373 inhibitor后KYSE410的遷移能力及侵襲能力較陰性對照組顯著減弱(P＜0.01)。說明miR-373可以提高ESCC細胞的遷移及侵襲能力。
　　結論:
　　miR-373的過表達可以提高ESCC的細胞增殖、遷移及侵襲能力。抑制miR-373的表達可以減弱ESCC的細胞增殖、遷移及侵襲能力，促進腫瘤細胞的凋亡。
　　第三部分 miR-373對

14、食管鱗狀細胞癌作用機制的初步研究
　　目的:
　　miRNAs雖然不編碼蛋白質，但是可以通過堿基互補配對的方式與mRNA的3'-UTR區(qū)域結合，導致mRNA的降解或抑制其轉錄后翻譯。通過生物信息學軟件，我們預測到miR-373存在多個潛在靶基因，結合在ESCC中與侵襲、轉移有關的基因，我們選擇TIMP3來進行下一步的研究，探索TIMP3是否為miR-373的直接靶基因來影響ESCC細胞的生物學行為。
　　方法:

15、　　檢測轉染前后ESCC細胞中TIMP3蛋白表達的差異，雙熒光素酶實驗驗證TIMP3是否為miR-373的直接靶基因，同時通過功能實驗進一步驗證TIMP3是否影響miR-373對ESCC細胞的遷移及侵襲作用。
　　結果:
　　1.轉染miR-373 mimics后，ECA109細胞中TIMP3蛋白的相對表達量要顯著低于陰性對照組。轉染miR-373 inhibitor后，KYSE410細胞中TIMP3蛋白的相對表達量要顯著高

16、于陰性對照組。
　　2.雙熒光素酶實驗顯示，TIMP3-3'UTR-WT與miR-373 mimics共轉染到人HEK293T細胞中，其熒光值比陰性對照組下降37％，而TIMP3-WT/NC，TIMP3-Mut/NC及TIMP3-Mut/miR-373之間沒有顯著差異。
　　3.無3'-UTR區(qū)域的pcDNA3.1-TIMP3和miR-373 mimics共轉染到ECA109細胞中。pcDNA3.1-TIMP3能夠減弱miR