戊型肝炎規(guī)范化實(shí)驗(yàn)室診斷模式的建立.pdf

1、目的：1.系統(tǒng)評(píng)估我國(guó)主流HEV抗原/抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的診斷靈敏度、特異度及相互間結(jié)果符合度，形成可指導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的HEV血清學(xué)檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量報(bào)告，以規(guī)范戊型肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷流程。2.設(shè)計(jì)出充分滿足臨床診斷靈敏度和特異度要求的能夠檢測(cè)HEV不同基因型病毒株的一步法熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-timeRT-PCR）檢測(cè)體系；并初步建立起HEV RNA考評(píng)血清盤(pán)和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，用于評(píng)價(jià)HEV核酸檢測(cè)的質(zhì)量評(píng)估。3.建立起不依

2、賴特殊設(shè)備和專業(yè)人員操作的快捷高效檢測(cè)HEV RNA的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)平臺(tái)。
　　方法:1.收集戊肝患者、健康體檢人群、風(fēng)濕免疫病患者及巨細(xì)胞病毒(CMV)和EB病毒感染早期患者血清樣本，分別用萬(wàn)泰、科華、貝爾、麗珠、新創(chuàng)HEV IgM和 IgG抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行平行檢測(cè)，以考察不同試劑盒各自的診斷靈敏度和特異度及相互間的結(jié)果符合率。2.用 HEV細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為中和抗原，通過(guò)中和抑制實(shí)驗(yàn)的方

3、法來(lái)驗(yàn)證各HEV抗體檢測(cè)試劑盒間檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)是否為真陽(yáng)性。3.在HEV ORF3高度保守區(qū)設(shè)計(jì)能檢測(cè)HEV不同基因型病毒株的PCR引物和探針引物，建立起一步法(Real time RT-PCR)檢測(cè)體系；將擬擴(kuò)增的HEV RNA目的基因片段構(gòu)建成質(zhì)粒，以建立HEV質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品，用于濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建；構(gòu)建HEV基因1-4型病毒株細(xì)胞培養(yǎng)體系，將培養(yǎng)上清液通過(guò)陰性血清倍比稀釋的方式初步建立評(píng)價(jià)HEV RNA檢測(cè)的考評(píng)血清盤(pán)。4.在

4、HEV基因組保守區(qū)域內(nèi)的6個(gè)位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物,建立起適用于不同基因型HEV RNA檢測(cè)的一步法逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)；采集臨床患者血清標(biāo)本和豬、兔糞便標(biāo)本分別用RT-LAMP方法、Real time RT-PCR及逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR(RT-nPCR)方法進(jìn)行并行檢測(cè)，以驗(yàn)證RT-LAMP方法的有效性；用其它病毒性肝炎病原體來(lái)驗(yàn)證其特異性，通過(guò)陽(yáng)性標(biāo)本HEV RNA梯度倍比稀釋的方式來(lái)驗(yàn)證其靈敏度。
　　

5、結(jié)果:1.不同廠家HEV IgM抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性，診斷靈敏度普遍欠佳，均未超過(guò)85％，特異度很好，未在非戊肝患者人群中發(fā)現(xiàn)HEV IgM抗體陽(yáng)性現(xiàn)象。2.不同廠家HEV IgG抗體檢測(cè)試劑盒在戊肝患者人群中檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性，診斷靈敏度較高(90%以上)，在非戊肝患者人群中，檢測(cè)結(jié)果有較大差異，以萬(wàn)泰和科華為例，萬(wàn)泰試劑盒在非戊肝患者人群中抗體陽(yáng)性率在16.5%-31.9%之間，而科華陽(yáng)性率僅為1.1%-3.

6、3%之間。3.通過(guò)中和抑制試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)萬(wàn)泰檢測(cè)試劑盒有假陽(yáng)性現(xiàn)象，進(jìn)一步說(shuō)明了萬(wàn)泰IgG抗體試劑盒檢測(cè)靈敏度較高，而其它幾種試劑盒容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。4. HEV抗原檢測(cè)試劑盒與IgM和IgG抗體檢測(cè)結(jié)果及HEV RNA檢測(cè)有很高的相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)IgM和IgG抗體均陰性而HEV抗原陽(yáng)性的病例。5.本研究建立了能夠高效擴(kuò)增包含兔HEV病毒株在內(nèi)的基因1-4型HEV病毒株的檢測(cè)，適用于血清和糞便等標(biāo)本，最低檢測(cè)限可達(dá)25copies/test

7、，較傳統(tǒng)RT-nPCR靈敏度高10倍以上；在103和106 copies/μl兩個(gè)濃度水平處，該方法批內(nèi)和批間精密度分別低于2%和3%，具有很好的重復(fù)性；經(jīng)臨床標(biāo)本驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)能夠用于戊肝患者及動(dòng)物宿主的血清和糞便標(biāo)本檢測(cè)，且靈敏度顯著高于RT-nPCR。6.本研究構(gòu)建了HEV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及HEV RNA考評(píng)血清盤(pán)，經(jīng)穩(wěn)定性驗(yàn)證評(píng)估，能夠初步滿足臨床應(yīng)用需求。7.本研究成功構(gòu)建了適用于包含兔HEV在內(nèi)基因1-4型HEV RNA RT-LA

8、MP檢測(cè)方法。該方法最低檢測(cè)限度為5copies/test，顯著優(yōu)于RT-nPCR技術(shù)，略優(yōu)于Real time RT-PCR技術(shù)。與HAV,HBV和HCV患者血清標(biāo)本對(duì)無(wú)交叉反應(yīng)，特異度良好。233份血清或糞便標(biāo)本對(duì)該技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)效能驗(yàn)證，并將該方法與Real time RT-PCR和RT-nPCR分別進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果顯示RT-LAMP和Real time RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性率顯著高于RT-nPCR，而兩者間檢測(cè)符合率高達(dá)92%，

9、未發(fā)現(xiàn)Real time RT-PCR或RT-nPCR檢測(cè)陽(yáng)性而RT-LAMP檢測(cè)陰性的標(biāo)本。
　　結(jié)論：1.不同廠家HEV IgM抗體檢測(cè)試劑盒之間的檢測(cè)結(jié)果差異較小，對(duì)戊肝臨床診斷的靈敏度均在80%以上，特異性較高。HEV IgG抗體檢測(cè)試劑盒較 IgM檢測(cè)試劑盒更靈敏，但診斷特異度在不同廠家之間差異較大，經(jīng)綜合比較發(fā)現(xiàn)科華IgG抗體檢測(cè)試劑盒較適合于戊肝臨床診斷檢測(cè)，與IgM抗體檢測(cè)試劑盒配伍使用，能很好地彌補(bǔ)其靈敏度不足，

10、又能有效解決自身診斷特異度不足的問(wèn)題。2.萬(wàn)泰IgG抗體試劑盒較其它3種廠家靈敏度最高，更加適合于流行病學(xué)調(diào)查，鑒于科華試劑盒較低的檢測(cè)靈敏度，不適合應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。3.HEV抗原檢測(cè)試劑盒與HEV RNA檢測(cè)有很好的相關(guān)性，雖然其出現(xiàn)最早，能有效縮短HEV感染的檢測(cè)窗口期，但鑒于戊肝的發(fā)病特點(diǎn)，當(dāng)患者有癥狀就醫(yī)時(shí)抗體往往已經(jīng)出現(xiàn)，因此HEV抗原檢測(cè)在臨床應(yīng)用中的價(jià)值仍需進(jìn)一步研究，本研究未發(fā)現(xiàn)其能提高HEV感染診斷效率的證據(jù)。4.

11、本研究建立了能夠高效擴(kuò)增包含兔HEV病毒株在內(nèi)的基因1-4型HEV病毒株的HEV RNA一步法Real time RT-PCR檢測(cè)體系，適用于血清和糞便等標(biāo)本的檢測(cè)，具有檢測(cè)靈敏度、特異性高，重復(fù)性好等特點(diǎn)，值得進(jìn)一步優(yōu)化后進(jìn)行商品化嘗試。5.本研究構(gòu)建了Realtime RT-PCR所需的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，該標(biāo)準(zhǔn)品易制備、易精確定量，儲(chǔ)存條件簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好。解決了HEV RNAReal time RT-PCR檢測(cè)臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用的瓶頸。6

12、.本研究初步制備了HEV RNA檢測(cè)考評(píng)血清盤(pán)，對(duì)Real-time RT-PCR檢測(cè)HEV RNA的臨床推廣所面臨的標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果可控可比的問(wèn)題進(jìn)行了初步探索。該血清盤(pán)目前針對(duì)我國(guó)HEV感染人群和動(dòng)物宿主中主要基因型(基因4型)的特點(diǎn)而制備，未來(lái)仍需進(jìn)一步完善豐富其覆蓋的基因型別。7.本研究初步建立了RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)HEV RNA的新方法，在特異度、靈敏度和臨床標(biāo)本檢測(cè)驗(yàn)證中表現(xiàn)出了良好效果。該方法不需要昂貴的設(shè)備和繁瑣的電泳分析