核酸的檢測(cè)技術(shù)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究.pdf

1、作為生命體中遺傳信息的攜帶者，核酸在生命體的延續(xù)以及進(jìn)化過程中發(fā)揮著極其重要的作用。由于其在遺傳學(xué)、法醫(yī)鑒定、親子鑒定以及物種進(jìn)化研究等方面的廣泛應(yīng)用，從而使對(duì)于核酸的研究顯得越來越重要。對(duì)于核酸的研究主要包括核酸的定性和定量研究。在核酸的定量研究中主要應(yīng)用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)、高效液相色譜技術(shù)(HPLC)以及基礎(chǔ)的化學(xué)分析方法電位滴定法和新技術(shù)數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行定量分析的。在核酸的定性研究中，質(zhì)譜分析技術(shù)以及紅外光譜分析技術(shù)被

2、應(yīng)用其中。對(duì)于核酸方面的研究，本論文研究如下:
　　 1.核酸堿基腺嘌呤以及胞嘧啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制
　　 腺嘌呤以及胞嘧啶是脫氧核糖核酸( DNA)中的兩種堿基，由于兩種物質(zhì)都含有氨基基團(tuán)，因此具有一定的弱堿性。實(shí)驗(yàn)采用非水電位滴定法對(duì)兩種堿基的含量進(jìn)行測(cè)定。通過進(jìn)行滴定劑種類、滴定劑濃度、溶劑種類等因素進(jìn)行選擇優(yōu)化，最終確定了0.05mol/L的無水高氯酸溶液作為滴定劑，無水冰醋酸作為溶劑定性實(shí)驗(yàn)。并且在后續(xù)的研究中采用

3、了高效液相法對(duì)兩種堿基進(jìn)行了穩(wěn)定性研究，采用質(zhì)譜以及紅外光譜檢測(cè)對(duì)兩種堿基進(jìn)行了定性分析，并進(jìn)行了灰分以及樣品含水量的測(cè)定，經(jīng)過進(jìn)一步的分析得到兩種堿基標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量為:腺嘌呤以及胞嘧啶兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的含量分別為99.40±0.37％，99.50±1.07％。2
　　 2.數(shù)字PCR測(cè)定lambda DNA的含量
　　 數(shù)字PCR芯片技術(shù)是一項(xiàng)新興起來的檢定技術(shù)，由于其在測(cè)定過程中不需要標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)，且具有檢測(cè)濃度低、用量

4、少等特點(diǎn)，目前被應(yīng)用到了核酸含量的檢測(cè)研究中。本研究中采用數(shù)字PCR技術(shù)進(jìn)行l(wèi)ambdaDNA含量的測(cè)定，分析結(jié)果顯示:通過數(shù)字PCR測(cè)得的Lambda DNA的含量為2.428±0.1305μg。
　　 3.采用質(zhì)譜進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性研究
　　 質(zhì)譜作為目前分析化學(xué)中常用的分析方法之一，由于具有操作時(shí)間短、高通量、靈敏度度高等特點(diǎn)，被應(yīng)用到了單核苷酸多態(tài)性的實(shí)驗(yàn)研究中。本研究選用基質(zhì)輔助激光解析-飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)單核苷酸

5、多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建了線粒體DNA高可變區(qū)HV2區(qū)的序列載體，并且已構(gòu)建好的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)完成以后進(jìn)一步進(jìn)行PEX延伸反應(yīng)以獲得目的片段。隨后采用固相萃取純化方法以及鏈霉親和素磁珠與ZipTip相結(jié)合的方法對(duì)通過單堿基延伸反應(yīng)得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，最終實(shí)驗(yàn)將純化得到的PCR產(chǎn)物采用質(zhì)譜分析設(shè)備進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)共測(cè)定了3個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終實(shí)驗(yàn)測(cè)定的單堿基分子量的結(jié)果與理

6、論上的分子量結(jié)果基本上是一致的。
　　 4.測(cè)序反應(yīng)中三種純化方法的比較
　　 本研究目的在于建立一種純化效果好的PCR產(chǎn)物純化方法，進(jìn)而為后續(xù)的測(cè)序反應(yīng)提供一個(gè)良好的條件以便得到準(zhǔn)確的測(cè)序結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中以構(gòu)建好的短串聯(lián)重復(fù)片段D2S441為模板進(jìn)行分析PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物采用Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行片段大小的分析，隨后分別用固相萃取、鏈霉素親和磁珠以及純化試劑盒等方法純化實(shí)驗(yàn)得到的PCR產(chǎn)物，進(jìn)行測(cè)序以

7、及無機(jī)離子含量的檢測(cè)。最終結(jié)果表明固相萃取純化方法在純化效果方面優(yōu)于純化試劑盒法以及鏈霉親和素磁珠法。
　　 5.轉(zhuǎn)基因油菜TOPAS19/2質(zhì)粒分子多家協(xié)同實(shí)驗(yàn)及不確定度評(píng)定
　　 質(zhì)粒分子是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品核酸定量檢測(cè)的一類新型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有易制備，周期短，成本低等特點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，并協(xié)同7家實(shí)驗(yàn)室對(duì)轉(zhuǎn)基因油菜TOPAS19/2質(zhì)粒分子進(jìn)行了基因組的可替代性研究、協(xié)同實(shí)驗(yàn)研究及不確定度評(píng)定。對(duì)多家定值