沉默BubR1對人HBV陽性肝癌細胞增殖的影響及可能機制.pdf

1、目的：
　　檢測BubR1在人肝癌細胞中的表達，觀察沉默BubR1后對人HBV（Hepatitis B virus）相關(guān)肝癌細胞增殖、凋亡和周期的影響，驗證BubR1和HBx(HBV X protein)蛋白的相互關(guān)系以及BubR1影響肝癌細胞活性可能的機制。
　　方法：
　　1.運用 RT-PCR及 Western Blot技術(shù)檢測人 HBV陽性肝癌細胞株（HepG2.2.15）及HBV陰性肝癌細胞株（HepG2、S

2、MMC7721和Huh7）中BubR1的表達，并篩選出BubR1高表達細胞株。
　　2.設(shè)計并合成3對針對BubR1的特異性小干擾RNA(small interfering RNA， siRNA)，通過陽離子脂質(zhì)體法進行瞬時轉(zhuǎn)染。體外培養(yǎng)肝癌細胞，實驗共設(shè)Nomal組、Control-siRNA組及BubR1-1、BubR1-2、BubR1-3各轉(zhuǎn)染組
　　3.運用RT-PCR及Western Blot技術(shù)檢測各實驗組中Bu

3、bR1在mRNA和蛋白水平的變化，篩選出沉默效果最好的BubR1-siRNA序列。
　　4.通過MTT比色法檢測沉默BubR1后細胞增殖能力的改變，運用Annexin V-FITC/PI染色流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡和周期的改變。
　　5.通過Western Blot技術(shù)檢測沉默BubR1后各實驗組細胞MAPKs各信號通路（ERK1/2、JNK、p38MAPK）節(jié)點分子、NF-κB信號通路及凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Caspase-

4、3）表達量改變，以明確BubR1影響肝癌細胞活性可能的機制。
　　6.通過免疫共沉淀及雙色免疫熒光結(jié)合激光共聚焦技術(shù)分別檢測 HBx蛋白與BubR1蛋白在HBV陽性肝癌細胞中的相互作用關(guān)系及在細胞中的定位。
　　結(jié)果：
　　1. RT-PCR及Western Blot結(jié)果均顯示，在四種肝癌細胞系中，BubR1基因均呈陽性表達，且在HepG2.2.15細胞中BubR1 mRNA和蛋白水平皆呈相對最高表達。
　　2.

5、分別用3對特異性BubR1-siRNAs轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，24h和48h后分別提取mRNA和蛋白，發(fā)現(xiàn)3個轉(zhuǎn)染組（BubR1-1、BubR1-2、BubR1-3組）的mRNA和蛋白表達水平相比較Nomal組、Control-siRNA組下降，且BubR1-3組抑制效果最明顯。
　　3. MTT比色法檢測細胞增殖及平板克隆實驗發(fā)現(xiàn)，BubR-3轉(zhuǎn)染組HepG2.2.15細胞增殖能力較Nomal組、Control-siRN

6、A組明顯受到抑制。
　　4.流式細胞術(shù)檢測顯示，BubR1-3轉(zhuǎn)染組細胞的凋亡率增高，G1期細胞顯著減少，S期細胞明顯增加，即細胞阻滯于S期。
　　5. Western Blot檢測顯示，沉默BubR1可顯著抑制p-ERK蛋白和p-NF-κB蛋白的表達，而p-P38、p-JNK1/2以及各通路非磷酸化蛋白的表達較Nomal組、Control-siRNA組相比無明顯變化。
　　6. Western Blot檢測顯示，沉默

7、BubR1，BubR1-3組中Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達水平較Nomal組、Control-siRNA組增高。
　　6.免疫共沉淀技術(shù)顯示，瓊脂糖珠、BubR1及HBx能夠共同形成瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，HBx與BubR1能直接或間接地結(jié)合。雙色免疫熒光激光共聚焦檢測顯示，BubR1及HBx在HepG2.2.15細胞質(zhì)和細胞核中均有分布，且BubR1與HBx在HepG2.2.15細胞核內(nèi)共定位。
　　結(jié)論：