幽門螺桿菌感染對胃黏膜上皮細胞DNA損傷修復(fù)機制的影響.pdf

1、背景與目的:
　　胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一。最新全球癌癥的流行病學(xué)數(shù)據(jù)表明：全球胃癌男、女性新發(fā)病人數(shù)分別占癌癥的第4位和第5位，男、女胃癌病死率分別占癌癥相關(guān)死亡的第3位和第5位。我國是胃癌發(fā)病大國，全球每年新發(fā)胃癌半數(shù)以上在中國。大多數(shù)胃癌病例確診時已處晚期，治療方法有限、預(yù)后不佳。明確胃癌的發(fā)生機制，制定有效的胃癌一級預(yù)防策略迫在眉睫。
　　DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand breaks, DSB

2、s）是一種最嚴重的DNA損傷形式，其精確修復(fù)依賴于DNA損傷信號通路的激活傳遞及各種修復(fù)蛋白的協(xié)同發(fā)揮功能。細胞自噬對基因組穩(wěn)定亦發(fā)揮重要作用，細胞自噬的缺陷可通過影響DNA損傷修復(fù)過程中關(guān)鍵蛋白的活性導(dǎo)致DNA修復(fù)異常。DNA損傷修復(fù)機制的缺陷易引起基因組的不穩(wěn)定，而這種基因組的不穩(wěn)定性毫無疑問對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起著十分重要的促進作用。
　　目前認為，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp）感染是慢性非萎縮性胃

3、炎→萎縮性胃炎→腸上皮化生→異型增生→胃癌這一演變過程的始動因素，然而其確切致癌機制尚不清楚。Hp感染是否可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞發(fā)生DSBs？DNA損傷反應(yīng)信號通路及細胞自噬如何變化？Hp感染是否可以通過干擾 DNA的修復(fù)機制進而導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定性，引起細胞生物學(xué)功能的異常......？本研究將針對以上問題進行探討，為闡明Hp的致癌機制提供新的理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　（一）Hp感染誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞DSBs的體內(nèi)外研

4、究：
　　1.收集慢性非萎縮性胃炎（chronic non-atrophic gastritis, CNAG）、腸上皮化生（intestinal metaplasia, IM）、異型增生（dysplasia, Dys）和胃癌（gastric cancer, GC）組織，通過免疫組化檢測各病變階段γH2AX（DSBs的檢測指標）的表達，并分析其與Hp感染的關(guān)系；
　　2.通過建立Hp活菌體外與GES-1細胞共培養(yǎng)細胞模型，We

5、stern blot檢測γH2AX的表達，中性單細胞凝膠電泳實驗檢測DSBs；
　　3.構(gòu)建Hp感染蒙古沙鼠動物模型，免疫組化檢測胃黏膜組織γH2AX的表達。
　?。ǘ?Hp感染對DNA損傷修復(fù)信號通路及細胞自噬的影響：
　　1.免疫組化檢測不同病變階段胃黏膜標本 DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬相關(guān)蛋白的表達，并分析其與Hp感染的關(guān)系；
　　2.檢測Hp活菌體外與GES-1細胞共培養(yǎng)后DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬

6、相關(guān)指標的變化；
　　3.利用Ad-mRFP-GFP-LC3腺病毒檢測Hp活菌作用GES-1細胞后自噬流的變化；
　　4.流式細胞術(shù)檢測Hp活菌與GES-1細胞培養(yǎng)后細胞周期變化；
　　5. Hp活菌與Rad51過表達或敲除的GES-1細胞共培養(yǎng)，檢測DSBs及相關(guān)指標的變化。
　?。ㄈ┘毎允蓪p誘導(dǎo)GES-1細胞DSBs損傷修復(fù)的影響：
　　1. Hp活菌與自噬干預(yù)后GES-1細胞共培養(yǎng)，檢測DSB

7、s及相關(guān)指標、Rad51的表達和細胞周期的變化；
　　2.同時干預(yù)GES-1自噬水平及Rad51表達水平，觀察自噬對DNA損傷修復(fù)的調(diào)節(jié)是否依賴于Rad51的表達。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬〩p感染誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞DSBs的體內(nèi)外研究：
　　我們通過檢測不同病變階段胃黏膜標本中γH2AX的表達，發(fā)現(xiàn)其在胃黏膜癌變過程中發(fā)揮重要作用，且γH2AX表達與胃癌部位、大體分型、分化程度、腫瘤浸潤深度、TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移

8、相關(guān)，與胃癌預(yù)后呈負相關(guān)；進一步分析發(fā)現(xiàn)γH2AX在Hp陽性IM與Dys組織的表達高于Hp陰性組。通過構(gòu)建Hp活菌體外與GES-1細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Hp感染可誘導(dǎo)GES-1細胞發(fā)生DSBs。進一步在蒙古沙鼠模型進行驗證，發(fā)現(xiàn) Hp感染可誘導(dǎo)蒙古沙鼠胃黏膜上皮細胞γH2AX的高表達。上述實驗結(jié)果提示：Hp體內(nèi)外感染均可誘導(dǎo)胃黏膜上皮細胞發(fā)生DSBs。
　?。ǘ〩p感染對DNA損傷修復(fù)信號通路及細胞自噬的影響：
　　我們檢測了不

9、同胃黏膜病變階段中DNA損傷修復(fù)通路、細胞自噬相關(guān)蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)通路及細胞自噬參與胃黏膜的癌變過程，且與胃癌臨床病理參數(shù)密切相關(guān)，其中Beclin-1、p62和BRCA2表達與胃癌預(yù)后呈正相關(guān)，而p-ATM（S1981）、Rad51表達與胃癌預(yù)后呈負相關(guān)。
　　進一步分析各病變階段Hp陽性亞組與Hp陰性亞組間的差異，發(fā)現(xiàn)：①在CNAG和IM病變階段，Hp陽性亞組中p-ATM（S1981）、p-Chk2（T68）、p

10、-p53（S15）的表達均高于Hp陰性亞組；②在Dys病變階段，Hp陽性亞組中Rad51的表達低于Hp陰性亞組。
　　在細胞實驗中，我們發(fā)現(xiàn)Hp活菌作用GES-1細胞6h后即可激活DNA損傷反應(yīng)信號通路以及細胞自噬，誘導(dǎo)細胞發(fā)生S期阻滯；但隨著作用時間延長，12h后Rad51蛋白表達和自噬水平均呈下降趨勢；轉(zhuǎn)染Rad51質(zhì)粒對Hp誘導(dǎo)的GES-1細胞DSBs起保護作用，敲除Rad51則作用相反。
　　動物實驗進一步證實，Hp

11、感染12月亞組蒙古沙鼠胃黏膜組織p62表達水平高于對照組；Hp感染18月亞組蒙古沙鼠胃黏膜組織Rad51表達水平低于對照組。
　　上述實驗結(jié)果提示：DNA損傷修復(fù)信號通路在胃黏膜癌變早期發(fā)揮重要的抗癌屏障作用；Hp感染可激活胃黏膜上皮細胞DNA損傷信號通路及細胞自噬，但隨著感染時間延長，Hp感染可下調(diào)自噬水平并導(dǎo)致 DNA同源重組修復(fù)能力下降。
　?。ㄈ┘毎允蓪p誘導(dǎo)GES-1細胞DSBs損傷修復(fù)的影響：
　　我

12、們采用兩種自噬激動（Rapamycin和饑餓處理）及自噬抑制劑（3-MA和BafA1）對GES-1細胞進行預(yù)處理，后與Hp活菌共培養(yǎng)；發(fā)現(xiàn)上調(diào)自噬可促進GES-1細胞Rad51表達，減少DSBs發(fā)生，而抑制自噬則下調(diào)GES-1細胞Rad51表達，并促進DSBs發(fā)生；進一步行補救實驗（即在上調(diào)自噬的同時敲除Rad51或抑制自噬的同時過表達 Rad51），發(fā)現(xiàn)細胞自噬對 DSBs的保護作用依賴于Rad51的表達。
　　結(jié)論：