T-2毒素和脫二氧喹賽多免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究.pdf

1、T-2毒素是由鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物中毒性較強(qiáng)的一種真菌毒素，是最常見(jiàn)的污染糧食類作物的幾種主要毒素之一。由于其毒性比較大且廣泛分布于自然界，對(duì)人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了極大危害，故建立一種高效、快速、靈敏的檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)其含量是非常有必要的。喹賽多雖然曾被當(dāng)作安全、高效的飼料添加劑來(lái)使用，但考慮到其通過(guò)食物鏈累積作用對(duì)人體可能產(chǎn)生的不良影響，所以也需要建立相應(yīng)的檢測(cè)方法來(lái)監(jiān)測(cè)其在食用動(dòng)物組織中的殘留量。因脫二氧喹賽多被確定為喹賽多

2、在動(dòng)物體內(nèi)代謝的殘留標(biāo)志物，本研究就是以此為基礎(chǔ)對(duì)喹賽多進(jìn)行藥物的殘留研究。本論文旨在建立檢測(cè)T-2毒素的抗體芯片免疫分析法和檢測(cè)脫二氧喹賽多的化學(xué)發(fā)光免疫分析法。
　　 ①在合成檢測(cè)抗原T-2-HS-BSA后，使用微量點(diǎn)樣毛細(xì)管將其點(diǎn)陣于瓊脂糖修飾的基片上，使用Cy5標(biāo)記的二抗，建立間接競(jìng)爭(zhēng)抗體芯片免疫分析法，用于檢測(cè)T-2毒素在小麥等糧食作物中的殘留。本研究在優(yōu)化點(diǎn)樣濃度、單抗工作濃度、封阻物質(zhì)及濃度和熒光二抗工作濃度后建立

3、了標(biāo)準(zhǔn)曲線，其檢測(cè)范圍(IC20～I(xiàn)C80)為0.005 ng/mL～9.58 ng/mL，半抑制濃度(IC50)為0.22 ng/mL，最低檢測(cè)限(LOD)為0.001 ng/mL。同時(shí)初步建立間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其檢測(cè)范圍為0.27 ng/mL～11.82 ng/mL，IC50為1.77 ng/mL，LOD為0.14 ng/mL。兩者相比，抗體芯片檢測(cè)法最低檢測(cè)限降低了2個(gè)數(shù)量級(jí)和檢測(cè)范圍加大了2個(gè)數(shù)量級(jí)。

4、在此基礎(chǔ)上進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，并運(yùn)用ELISA、抗體芯片和高效液相色譜法(HPLC)三種方法對(duì)加標(biāo)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，回收率基本達(dá)到分析檢測(cè)的要求。該方法簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度、高通量、上樣量小，適用于糧食作物中真菌毒素殘留監(jiān)測(cè)。
　　 ②采用魯米諾-過(guò)氧化氫發(fā)光系統(tǒng)，使用HRP標(biāo)記的二抗，建立了間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光免疫分析法，用于檢測(cè)脫二氧喹賽多(Cy4)在肉雞胸肌及肝臟組織中的殘留。首先使用Cy4多克隆抗體初步摸索并建立化學(xué)發(fā)光檢測(cè)

5、標(biāo)準(zhǔn)曲線，其檢測(cè)范圍為0.017～10.34μg/mL，IC50為0.42μg/mL，LOD為5.82 ng/mL。然后在獲得Cy4單克隆抗體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步詳盡地優(yōu)化了各項(xiàng)反應(yīng)參數(shù)，如包被液種類、包被原工作濃度、單抗工作濃度、封阻物質(zhì)、濃度及時(shí)間、標(biāo)品稀釋液中DMSO濃度、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)時(shí)間、酶標(biāo)二抗使用濃度、酶與底物反應(yīng)時(shí)間等，最終建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其檢測(cè)范圍為0.027 ng/mL～67.67 ng/mL，IC50為1.36 ng/mL，LO