CGRP通過NLRP3-ROS-Il-1β信號通路促進鼠成骨細胞增殖和分化的研究.pdf

1、目的:
　　骨是一種具有多種功能的復雜器官，其作用包括造血、調節(jié)和貯存關鍵礦物質、維持機體的平衡。當骨受到傷害時，急性炎癥刺激即刻發(fā)生，導致機體的先天性免疫調節(jié)隨之展開，與組織器官共同作用下，調控局部的骨損傷的修復和愈合。骨折發(fā)生后首先是在局部位置產(chǎn)生血腫，信號分子開始釋放同時巨噬細胞活化，隨后進入急性炎癥期開始產(chǎn)生促炎細胞因子、生長因子和趨化因子，在它們的作用下招募骨髓間充質干細胞分化為骨祖細胞，隨后進一步分化為成骨細胞和成纖維

2、細胞等。如果急性炎癥期炎癥反應失調，則可導致骨形成抑制，將影響骨折的愈合。作為起關鍵成骨作用的成骨細胞，其自身也能作為調控者調控炎性反應。作為主要的促炎細胞因子IL-1β一旦發(fā)生過表達或者其表達失衡，將導致炎性反應期延長，延緩骨的愈合。
　　NOD樣受體蛋白3炎性體(NACHT，LRR-and pyrin-domain(PYD)-containingprotein3,NLRP3)是一種存在于細胞內相對分子質量為700000左右的多

3、蛋白復合物，其激活后直接調控IL-1β的釋放。而經(jīng)由外周感覺神經(jīng)所分泌的降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)已經(jīng)證實其除了對骨創(chuàng)傷的修復重建有促進作用以外，也可調控機體的炎癥反應和IL-1β的表達。細胞線粒體內的活性氧(reactiveoxygen species，ROS)可以通過上調細胞內Ca2+流動，導致Ca2+過載，使線粒體出現(xiàn)功能障礙，使NLRP3直接激活。
　　綜上

4、所述，本項實驗通過加入外源性CGRP干預小鼠成骨細胞，觀察成骨細胞中NLRP3與IL-1β基因與蛋白表達情況，并檢測細胞內ROS含量與線粒體的數(shù)量，探究CGRP是否通過NLRP3-ROS-IL-1β信號通路促進成骨細胞的增殖和分化，進一步闡明CGRP調控炎癥反應來促進骨創(chuàng)傷修復的機制。
　　方法:
　　1.細胞培養(yǎng)和鑒定:取新生（出生24-48h內）BABL/c小鼠10只，在無菌環(huán)境下剪取顱骨，經(jīng)二次酶消化法提取細胞，放置于

5、濃度為5％CO2、溫度為37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，鏡下觀察其生長至細胞密度80％時傳代。傳代至第三代細胞用堿性磷酸酶(ALP)染色與茜素紅染色鑒定，同時保留第3代細胞用于后續(xù)實驗中。
　　2.實驗分組:將其按5×105個/孔密度接種于兩塊六孔板的8個孔中，并采用完全隨機設計分為4組（每組兩個孔），培養(yǎng)24 h后再分別加入不同濃度的CGRP，各組加入CGRP劑量為:A組（對照組）0 ng/ml、B組10 ng/ml、C組30 ng/ml、

6、D組100ng/ml。繼續(xù)培養(yǎng)3d后進行下一步實驗。
　　3.成骨細胞NLRP3、IL-1β的表達檢測:通過提取各組細胞的RNA與蛋白，進行RT-PCR、Western Blot和ELISA檢測成骨細胞中NLRP3、IL-1β的表達情況。
　　4.流式細胞儀檢測ROS含量:取已加入CGRP處理3d后的各組細胞并同時新增一組處于同樣狀態(tài)但未加藥的一組為空白對照組，經(jīng)一系列處理后，流式細胞儀檢測各組細胞內DCF（2'，7'-di

7、chlorofluorescin，2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酯）的熒光量從而得出ROS水平。
　　5.激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內線粒體數(shù)量:取狀態(tài)良好的第三代原代成骨細胞按1×105個/孔接種于4個激光共聚焦培養(yǎng)皿中，24h觀察其貼壁后分組加入CGRP，行相應處理后加入MitoSOX Red reagent，用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內線粒體數(shù)量。
　　6.CGRP對成骨細胞增殖和分化的作用:
　　6.1增殖:采用

8、CCK-8法分別在0h、24h、48h、72h檢測各組細胞的增殖情況。
　　6.2分化:ALP與茜素紅染色檢測各組細胞的分化情況。
　　結果:
　　1.細胞培養(yǎng)和鑒定:經(jīng)鏡下觀察細胞與成骨細胞特征相同，經(jīng)ALP與茜素紅染色鑒定結果示為陽性，確定所培養(yǎng)細胞為成骨細胞。
　　2.成骨細胞NLRP3、IL-1β的表達檢測:隨著CGRP加入濃度的增加，NLRP3與IL-1β的mRNA與蛋白表達呈現(xiàn)下降的趨勢。
　　

9、3.成骨細胞內ROS濃度與線粒體數(shù)量檢測:隨著CGRP加入濃度的增加，細胞內ROS濃度呈現(xiàn)下降的趨勢，同時線粒體數(shù)量也表現(xiàn)為明顯的減少。
　　4.CGRP對成骨細胞的增殖和分化作用:CGRP對成骨細胞的增殖活性有明顯的提高，同時分化能力也加強明顯。
　　結論:
　　1.研究表明，CGRP能抑制NLRP3激活從而使IL-1β分泌減少，從而起到對炎癥反應調節(jié)的作用;
　　2.檢測細胞內ROS含量與線粒體數(shù)量后，發(fā)現(xiàn)C