β-NGF基因克隆和誘導(dǎo)表達及其對角膜緣干細(xì)胞的作用.pdf

1、目的：構(gòu)建含有神經(jīng)生長因子（β-NGF）慢病毒表達載體pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF，使用Tet-on3G四環(huán)素誘導(dǎo)表達系統(tǒng)，研究不同劑量強力霉素（Dox）誘導(dǎo)β-NGF基因表達對體外培養(yǎng)角膜緣干細(xì)胞（LSCs）增殖的影響。
　　方法：
　　1、從SD大鼠腦組織提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆鼠的β-NGF基因完整編碼區(qū)，將β-NGF基因定向插入載體pLVX-TRE3G-IRES中。

2、>　　2、將重組載體pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF和載體pLVX-Tet3G分別轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞，制備收獲慢病毒；共感染空白HEK293FT細(xì)胞，同時用不同劑量強力霉素（Dox）誘導(dǎo)NGF表達（分為未轉(zhuǎn)染組、0、100、500和1000ng/ml Dox誘導(dǎo)表達組）。48h后，收集細(xì)胞，western-blot檢測各組細(xì)胞內(nèi)β-NGF表達情況。同時收集培養(yǎng)上清，①Elisa檢測各組上清內(nèi)β-NGF的分泌量；②制作條件

3、培養(yǎng)基，加入PC-12細(xì)胞培養(yǎng)基中進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，觀察PC-12細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況。
　　3、體外培養(yǎng)LSCs，慢病毒共感染LSCs，分為對照組(未轉(zhuǎn)染組)和誘導(dǎo)表達組〔實驗組A（pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF和pLVX-Tet3G共感染，Dox1000ng/ml）、實驗組B（pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF和pLVX-Tet3G共感染，Dox100ng/ml）、實驗組C（pLVX-TRE3G-IRES和pLVX

4、-Tet3G共感染，Dox1000ng/ml）〕進行培養(yǎng)，分別選取各組誘導(dǎo)表達48h后的細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光染色檢測NGF、p63、TrkA、p38表達。
　　4、相關(guān)數(shù)據(jù)作統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.雙酶切和測序鑒定重組質(zhì)粒pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正確。
　　2、β-NGF在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)被誘導(dǎo)表達，隨著Dox劑量增加，表達量增強；β-NGF在細(xì)胞培養(yǎng)基的上清內(nèi)表達，表達量隨Dox劑

5、量增加而增多。
　　3、誘導(dǎo)表達的條件培養(yǎng)基可誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞形態(tài)改變，表達神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）蛋白。
　　4、NGF在LSCs內(nèi)被誘導(dǎo)表達，隨著Dox劑量增加，NGF表達量增強；各實驗組p63、TrkA隨著NGF的表達量增加而降低，p38表達量的隨著NGF的表達量增加而增加。
　　結(jié)論：
　　1、成功重組慢病毒載體pLVX-TRE3G-IRES-β-NGF,轉(zhuǎn)染后β-NGF基因能夠在HEK293FT