EC-SOD在大鼠肝及缺血再灌注損傷中的表達變化.pdf

1、臨床上在進行肝臟手術如肝臟部分切除、肝臟移植以及處理嚴重肝臟外傷時往往需要暫時性阻斷肝臟血流一段時間后再重新恢復其血液供應。在這個過程中就造成了肝臟的缺血再灌注損傷（hepatic ischemiareperfusion injury，HIRI）。HIRI是肝臟外科手術過程中一種常見的病理生理現(xiàn)象。肝臟的缺血再灌注可引起嚴重的肝細胞損傷和肝功能障礙，這也是導致術后肝功能衰竭和病人預后較差的重要原因之一。研究已證實，導致這種損傷的主要機制

2、之一為氧化應激反應。缺血再灌注時機體會產(chǎn)生大量活性氧自由基(reac-tive oxygen species，ROS)。ROS包括超氧陰離子(O2-)、羥自由基(OH)和過氧化氫(H2O2)等。ROS的化學性質非?；顫?，可以破壞細胞內的蛋白質、DNA和脂類等生物大分子，引起細胞死亡。
　　超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutases， SOD)是機體內一種重要的抗氧化酶，負責清除O2-，它能將O2-轉化成H2O2和氧

3、，在機體抗氧化應激反應中具有重要作用。在哺乳動物SOD共有三種亞型:Mn-SOD存在于線粒體，Cu/Zn-SOD主要位于細胞質和細胞核。細胞外超氧化物歧化酶(extracellular SOD，EC-SOD)是唯一位于細胞外的SOD亞型，并通過其肝素結合結構域(heparin-binding domain，HBD)與細胞表面和細胞外基質相結合。其次，EC-SOD也存在于細胞外液，如血清，腦脊髓液，腹水和滑膜液等。以往對于SOD的功能研究

4、主要集中在Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的抗氧化作用。但最近的研究表明EC-SOD可能具有更強的抗氧化應激和抗炎作用。EC-SOD在肝臟缺血再灌注損傷模型的表達如何變化，是否也發(fā)揮了抗氧化作用，有待證實。
　　本研究通過無損傷血管夾夾閉通往大鼠肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂30 min后松開血管夾，制造大鼠70％肝臟缺血再灌注損傷模型，6小時后觀察肝臟組織的形態(tài)結構改變、MDA含量變化以及EC-SOD mRNA水平和蛋白水平的變化

5、，進一步探討缺血再灌注損傷過程中肝臟組織的氧化應激狀態(tài)以及EC-SOD的抗氧化作用，為肝臟缺血再灌注損傷的防治提供一條新思路。
　　目的:觀察大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型肝組織內的氧化應激狀態(tài)，觀察EC-SOD的表達變化，探討其在抗氧化應激反應中的作用。
　　方法:
　　1動物分組及缺血再灌注損傷模型的制備
　　Wister雄性大鼠12只，體重200±10 g，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，隨機分為兩組:對照組(

6、Con)和缺血再灌注損傷組(HIRI)，用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg)，參照Kohli等人的方法，分離肝血管和膽管蒂，以無創(chuàng)傷性血管夾夾閉通往肝左葉、肝中葉的血管和膽管蒂。30分鐘后去掉血管夾，恢復肝臟血液供應，制造70％肝實質的肝臟缺血再灌注損傷模型。對照組大鼠只分離血管和膽管蒂并不夾閉。6小時后收集血液，3000rpm離心10min，分離血清，用于ALT（丙氨酸氨基轉移酶）測定;處死大鼠取肝臟，一部分4％多聚甲醛中固

7、定進行HE染色，觀察肝組織形態(tài)學改變。一部分置于液氮中用于EC-SOD mRNA水平和蛋白水平檢測，以及MDA含量測定
　　2測定指標及方法
　　2.1血清ALT水平測定
　　血清ALT水平由全自動生化分析儀測定。
　　2.2 HE染色觀察大鼠肝臟的形態(tài)結構
　　肝組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn)Olympus光學顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)變化并進行圖象分析。
　　

8、2.3大鼠肝組織MDA含量測定
　　將從-70℃冰箱中取出的肝組織按照10mg/100μl加入預冷的勻漿緩沖液(50mmol/L磷酸鉀緩沖液，PH7.4，1mmol/L鹽酸苯甲脒，1mmol/LPMSF,0.1％Tween-20,0.5mol/L NaCl,1mmol/L EDTANa3,5mmol/Lβ-巰基乙醇），冰浴中勻漿，勻漿液4000rpm4℃離心20min，取上清即制成10％肝組織勻漿，肝組織勻漿內MDA含量采用南京建

9、成丙二醛(MDA)測定試劑盒測定。
　　2.4大鼠肝組織EC-SOD mRNA水平測定
　　采用Trizol提取肝組織總RNA。約3μg總RNA反轉錄成cDNA。以GAPDH為內參照，進行RT-PCR。分別以EC-SOD的擴增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示mRNA的相對表達量。
　　2.5大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平測定
　　采用Western blot法測定大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平。將大鼠肝組織制成勻漿

10、，離心后取上清。用改良Lowry法進行蛋白總量測定.電泳的蛋白上樣量為56 ug.經(jīng)過轉膜和封閉處理后，在PVDF膜上加入兔抗EC-SOD抗體，室溫靜置過夜。再加入熒光標記的抗兔IgG抗體.在雙色紅外線成像系統(tǒng)掃描照相并進行圖像數(shù)值分析。
　　結果:
　　1大鼠肝組織的形態(tài)學改變
　　光學顯微鏡下可見Con組大鼠肝細胞排列成條索狀，圍繞中央靜脈成放射狀排列，肝索間肝血竇大小均勻，無明顯擴張充血。而HIRI組大鼠的肝組織

11、淤血嚴重，肝血竇明顯擴張充血，肝細胞受壓萎縮，部分肝細胞胞漿染色變淺，胞質內出現(xiàn)空泡變性且空泡數(shù)量較多，但壞死不明顯。
　　2血清ALT水平測定
　　Con組大鼠血清中ALT為20.03±5.23U/L，而HIRI組血清ALT為87.43±9.06U/L。HIRI組大鼠血清ALT水平明顯高于Con組(P＜0.01)。
　　3肝漿內MDA的含量
　　Con組大鼠肝勻漿內的MDA含量為8.72±1.53mmol/g，

12、而HIRI組肝勻漿內的MDA含量為12.75±2.25 mmol/g。HIRI組大鼠肝勻漿內的MDA含量明顯高于Con組（P＜0.01）。
　　4肝組織EC-SOD mRNA的相對表達量
　　采用RT-PCR的方法測定大鼠肝組織內EC-SOD mRNA的相對表達量。Con組肝組織內EC-SOD mRNA的相對表達量為0.68±0.11，HIRI肝組織內EC-SOD mRNA的相對表達量為1.13±0.18，HIRI組大鼠肝組

13、織內EC-SOD mRNA水平明顯高于Con組(P＜0.01)。說明HIRI組大鼠肝組織內EC-SOD的基因表達水平升高。
　　5大鼠肝組織EC-SOD蛋白水平
　　Con組大鼠肝組織內EC-SOD的蛋白表達水平為0.74±0.14，HIRI組大鼠肝組織內EC-SOD的蛋白表達水平為1.10±0.22。HIRI組EC-SOD蛋白水平明顯高于對照組(P＜0.01)。說明HIRI組大鼠肝組織內EC-SOD的蛋白表達水平升高。