黃孢原毛平革菌T-DNA插入突變體系構(gòu)建研究.pdf

1、秸稈高效利用中的一個重要瓶頸技術(shù)是預(yù)處理技術(shù)。秸稈的微生物處理目前被認(rèn)為是最有前途的處理方法。鑒于秸稈的生物預(yù)處理技術(shù)還未成熟，仍存在著處理效率低，周期長等弱點，本研究旨在采用T-DNA隨機插入突變的方法，試圖對白腐真菌的模式菌種——黃孢原毛平革菌進行基因改造，進而獲得改良的性狀，最終服務(wù)于秸稈的高效生物預(yù)處理。 利用基因工程原理，成功構(gòu)建了雙元載體，這種載體以pCAMBIA1300為骨架，把原有的T-DNA序列替換為完整的潮霉

2、素B抗性基因，包括來自黃孢原毛平革菌的潮霉素抗性基因啟動子，來自大腸桿菌的潮霉素抗性基因hyg以及來自黃孢原毛平革菌的lip6終止子，如將此T-DNA轉(zhuǎn)入黃孢原毛平革菌基因組，理論上可以賦予黃孢原毛平革菌自身較高的潮霉素抗性。此抗性可作為T-DNA插入突變試驗的篩選標(biāo)記。 通過不同方案將雙元載體質(zhì)粒向農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化效率顯著不同。使用液氮速凍的方法轉(zhuǎn)化經(jīng)CaCl2處理的感受態(tài)農(nóng)桿菌，未出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，改變液氮處理時間、質(zhì)粒DNA

3、的用量及受體菌種類等因素，均未獲得轉(zhuǎn)化子，表明速凍的方法向農(nóng)桿菌引入質(zhì)粒比較困難；借助于誘動質(zhì)粒pRK2013，使用三親結(jié)合的方法順利將雙元載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌，并且轉(zhuǎn)化效率較高。至此，用于侵染黃孢原毛平革菌雙元載體系統(tǒng)構(gòu)建完成。 對含上述雙元載體系統(tǒng)的農(nóng)桿菌侵染黃孢原毛平革菌進行了初步研究，通過調(diào)節(jié)真菌起始材料，共培養(yǎng)比例，誘導(dǎo)劑AS的使用濃度等因素，均未獲得轉(zhuǎn)化子。 本試驗過程中，因多次出現(xiàn)假陽性結(jié)果，雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建及