利用小鼠過表達模型研究hHole和Pygo1基因在病理性心肌肥厚發(fā)生中的作用.pdf

1、病理性心肌肥厚(Pathological Cardiac Hypertrophy，PCH)是臨床各類心臟疾病發(fā)展終末期的一個共同病理過程。據(jù)報道，該疾病在全球范圍內的人群發(fā)病率約0.2％，在我國的成人群體中發(fā)病率約0.18％，約100萬患者，且呈逐年增長趨勢。PCH的發(fā)生、發(fā)展涉及多基因、多通路、多環(huán)節(jié)及多層次，迄今至少已發(fā)現(xiàn)有20個基因1400多種突變與PCH的發(fā)生相關。但仍有許多調控基因有待鑒定，其發(fā)生、發(fā)展的分子機制亦有待闡明。<

2、br>　　hHole與Pygo1均是在脊椎動物成體心臟組織中特異性高表達的基因，我們的前期研究結果顯示在人類心衰的心肌標本中，hHole和Pygo1的均出現(xiàn)異常表達，然而對于hHole和Pygo1基因功能的研究，尤其是在心臟中的功能研究，迄今國際上尚未見相關報道。因此本文首先應用生物信息學方法，對人HOLE及人PYGO1蛋白的基本理化性質、結構特征等進行預測分析，并進一步通過體內遺傳修飾手段構建心肌特異性過表達的轉基因動物模型，旨在通過

3、建立hHole和Pygo1過表達轉基因小鼠模型，分別探討hHole和Pygo1在PCH發(fā)生中的作用，并進一步闡明其潛在的作用機理。
　　一、心肌特異性過表達hHole阻遏ISO誘導的病理性心肌肥厚
　　Hole基因作為一個在心臟發(fā)育和成體期均有高表達的基因，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)十多年，但國際同行們似乎一直忽視了它在體內的生物學功能，Hole基因的生物學功能迄今仍是一片空白。我們的前期研究結果揭示，HOLE蛋白具有ERK結合位點(D-d

4、omain)和結合SH3結構域的多聚脯氨酸序列(PXXP)，且上述結構域對SRF肥大信號具有一定的抑制作用。此外，有報道發(fā)現(xiàn)人類hHole基因（TMEM121）內部PXXP位點的SNP與人類先天性心臟病存在一定的相關性，似乎使得hHole基因在心臟中的功能變得可以預知。
　　在前期研究中，我們還發(fā)現(xiàn)在人類擴張型心肌病患者中，hHolemRNA表達顯著升高，進一步在體內外水平分析心肌肥厚的小鼠模型及心肌細胞肥大的細胞模型中Hole的

5、表達水平，發(fā)現(xiàn)Hole在mRNA和蛋白水平較對照組均有顯著升高，上述研究結果提示Hole可能參與病理性心肌肥厚的調控。
　　為研究hHole基因在病理性心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，我們首先應用生物信息學方法對人類hHole基因的基本結構、理化性質等進行了預測分析，其次，為從實驗水平驗證人類hHole基因的相關功能，我們應用體內遺傳修飾手段，首次建立了心臟特異性hHole過表達轉基因小鼠模型。我們發(fā)現(xiàn)轉基因小鼠在正常的生理條件

6、下，表型正常，但效應于異丙腎上腺(ISO)刺激，轉基因的小鼠較WT小鼠表現(xiàn)出抵抗ISO誘發(fā)的心肌肥厚，具體表現(xiàn)為心肌細胞面積的細微變化輕微的心肌纖維沉積、良好的心功能輸出等。上述結果初步證實hHole基因可能是PCH的抑制因子，我們的研究結果首次從分子水平上揭示hHole基因在脊椎動物成體內的生物學功能。
　　為深入研究hHole抑制病理性心肌肥厚的作用機理，我們進一步應用qRT-PCR方法分析TG小鼠中MAPK家族成員在mRNA

7、水平的表達變化，結果發(fā)現(xiàn)ISO刺激的轉基因小鼠中ERK1，ERK2的mRNA表達水平均有下調，JNK或P38在mRNA水平則無顯著性變化。進一步應用WB方法檢測轉基因小鼠心臟組織中p-ERK及t-ERK的表達變化，結果顯示:效應于ISO刺激，心肌特異性過表達hHole可顯著抑制ERK1/2的磷酸化。上述研究結果提示hHole可能通過ERKs信號途經(jīng)在轉錄和翻譯后水平雙重調控病理性心肌肥厚。
　　二、心肌特異性過表達Pygo1自主調

8、控病理性心肌肥厚
　　果蠅Pygopus基因是2002年發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典WNT信號通路的關鍵成員。具有調控組織發(fā)育、染色質重塑、轉錄激活等多種重要生物學功能在脊椎動物中Pygopus有兩種同源基因，分別是Pygopus1和Pygopus2(Pygo1, Pygo2)。在成體小鼠中，Pygo2基因在多種組織中廣泛表達，但Pygo1僅在心臟組織中特異性高表達。目前對Pygo1的研究相對甚少，其在脊椎動物成體心臟中的功能研究更是一片空白。

9、r>　　Pygo1基因在成體心臟中特異性高表達是否提示其可能與心臟功能密切相關？前期研究發(fā)現(xiàn)人類心肌肥厚患者中PGYO1蛋白表達異常升高，心肌肥厚小鼠模型中Pygo1在mRNA和蛋白表達與“胚胎基因”ANF、β-MHC、SK-α-actin的表達呈一致性上調。進一步在體外細胞水平的研究結果發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定過表達Pygo1的細胞系無需其它病理性肥厚刺激因子，即表現(xiàn)出細胞體積的增大和肥厚“標志基因”的上調;而在干擾Pygo1表達的細胞系中，被干擾細

10、胞系可抑制由ISO或胎牛血清誘導的心肌肥大。以上結果提示Pygo1基因可能是調控PCH發(fā)生、發(fā)展的一個關鍵性作用因子。
　　為深入研究Pygo1的生物學功能，我們首先應用生物信息學方法對人類Pygo1基因的基本結構及理化性質進行預測分析。其次，為進一步證實該基因在動物整體水平的表達效應，我們將Pgyo1基因構建在α-MHC啟動子之下，并通過囊胚注射獲得了過表達Pygo1的轉基因小鼠后代，初步研究發(fā)現(xiàn)不需要任何肥大病理因子的刺激，P

11、ygo1過表達成年小鼠中的“胚胎基因”ANP、β-MHC、SK-α-actin在mRNA水平的表達顯著性上調，并伴有心肌細胞體積的增大及年齡相關的心肌纖維化等。我們的研究結果首次揭示Pygo1基因可自主調控PCH的發(fā)生，但其作用機理有待進一步的研究。
　　病理性心肌肥厚的發(fā)生、發(fā)展機制非常復雜，我們首次應用生物信息學方法預測分析人hHole及Pygo1基因的基本理化性質及基本結構等，并在動物整體水平驗證了Hole及Pygo1在小鼠