正常獼猴玻璃體腔注射人源黑視蛋白腺相關病毒表達及安全性研究.pdf

1、目的:
　　首先通過人源黑視蛋白腺相關病毒(pAAV2/8-CMV-hMel-p2A-YFP)轉染離體培養(yǎng)的293T細胞、正常大鼠原代視網(wǎng)膜節(jié)細胞、正常大鼠視網(wǎng)膜，驗證構建的病毒載體轉染及表達性能。進一步通過對獼猴行兩種術式(1.直接玻璃體腔注射;2.內界膜剝除+玻璃體腔注射)病毒注射，觀察該病毒在靈長類動物體內的轉染及表達，并對比兩種術式對病毒表達的影響;探索正常獼猴視網(wǎng)膜節(jié)細胞表達人源黑視蛋白的對光反應功能;觀察手術方式及病毒

2、在獼猴體內轉染的安全性。為該光遺傳治療策略在治療人視網(wǎng)膜變性疾病提供理論基礎和實踐指導。
　　方法:
　　1.將構建的共表達人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白的腺相關病毒，通過體外轉染離體細胞(293T細胞系，正常大鼠原代視網(wǎng)膜節(jié)細胞)及在體轉染正常大鼠視網(wǎng)膜觀察人源黑視蛋白及YFP的表達，驗證該病毒的轉染、表達能力。
　　2.將3只正常獼猴的6眼分為兩組，3只右眼為一組，行后段玻璃體切除+內界膜剝除+C3F8氣體填充+玻璃

3、體腔注射30μL構建的腺相關病毒(病毒滴度9.71×1012v.p/mL);3只左眼為一組，直接玻璃體腔注射30μL病毒，注射病毒3個月后腹腔注射戊巴比妥鈉將獼猴安樂死，取下視網(wǎng)膜計數(shù)獼猴視網(wǎng)膜YFP陽性細胞，對比內界膜剝除對病毒轉染效率的影響，并采用全細胞膜片鉗技術記錄YFP陽性細胞的對光反應功能。
　　3.術前及術后1月、2月、3月對獼猴行眼底照相、自發(fā)熒光、OCT等眼部形態(tài)學檢測;術前及術后3月對獼猴的FERG、FVEP指標

4、進行檢測，并行統(tǒng)計學分析，觀察病毒的注射及手術的處理是否會引發(fā)嚴重的眼部并發(fā)癥。
　　4.術前及術后3個月對獼猴外周血中炎癥因子、肝功能、腎功能等血液檢驗學指標進行檢測，并行統(tǒng)計學分析，研究我們所使用的腺相關病毒是否會引起正常獼猴全身嚴重的免疫、炎癥反應。
　　5.術后3個月腹腔注射戊巴比妥鈉將獼猴安樂死，對心臟、肝臟、腎臟等全身臟器行組織病理學觀察，研究我們所使用的腺相關病毒是否會引起基因突變，導致腫瘤等疾病的發(fā)生。

5、>　　結果:
　　1.構建的人源黑視蛋白腺相關病毒在體外細胞系(293T細胞系、原代神經(jīng)元)及正常嚙齒類動物(LE大鼠)視網(wǎng)膜均有較好的轉染力，可共表達人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白。
　　2.構建的人源黑視蛋白腺相關病毒在正常獼猴視網(wǎng)膜有較好的轉染力，YFP熒光蛋白主要表達于節(jié)細胞，視網(wǎng)膜鋪片可見YFP陽性細胞的分布均為周邊高，中央低，內界膜剝除眼和直接玻璃體腔注射眼之間未見統(tǒng)計學差異。
　　3.全細胞膜片鉗技術記錄到

6、470nm藍光刺激時，獼猴視網(wǎng)膜YFP陽性神經(jīng)節(jié)細胞能夠對光反應，產(chǎn)生內向電流及動作電位。
　　4.術前及術后1月、2月、3月眼底照相、眼底自發(fā)熒光、OCT等形態(tài)學檢測結果表明:內界膜剝除眼術后可見內界膜剝除證據(jù)，未見手術并發(fā)癥，眼部功能學檢測(FERG，F(xiàn)VEP)術前及術后3個月比較無統(tǒng)計學差異。
　　5.血液檢驗學指標結果表明:獼猴肝功能、腎功能、心肌酶譜、炎性因子等指標術前及術后3月對比未見統(tǒng)計學差異。
　　6.

7、全身各臟器石蠟切片HE染色未見明顯病理學改變。
　　結論:
　　1.證實了構建的人源黑視蛋白腺相關病毒轉染及表達能力正常，可共表達人源黑視蛋白及YFP熒光蛋白。
　　2.證明了在正常獼猴非感光視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞能夠通過光遺傳學技術表達人源黑視蛋白，獲得對光反應功能。
　　3.建立了獼猴后段玻璃體切除+內界膜剝除+C3F8氣體填充+玻璃體腔注射病毒的手術方式，研究了正常獼猴玻璃體腔注射和內界膜剝除+玻璃體腔注射兩種轉