肝素減輕中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷.pdf

1、目的：
　　NETs是由中性粒細(xì)胞受到病原體、細(xì)胞因子以及化學(xué)物質(zhì)刺激后核內(nèi)組分釋放到細(xì)胞外形成的一種網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，具有限制病原體擴(kuò)散，分泌殺菌蛋白殺滅病原體等多種有益作用。過量的NETs可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，從而在膿毒癥的發(fā)病機(jī)制中占有重要的地位。肝素具有抗凝及抗炎作用，能夠減輕膿毒癥內(nèi)皮細(xì)胞損傷及改善膿毒癥患者的預(yù)后。但肝素能否通過NETs的途徑發(fā)揮內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用尚不得而知。本研究通過PMA刺激PMN提取NETs，誘導(dǎo)體外培

2、養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步明確NETs對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，同時(shí)探討肝素能否減輕NETs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，發(fā)揮對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　方法：
　　從健康志愿者中提取外周血，利用Percoll-Histopaque密度梯度離心法提取PMN，應(yīng)用佛波酯(PMA)刺激PMN產(chǎn)生NETs，采用免疫熒光染色聯(lián)合熒光酶標(biāo)儀檢測對NETs定性及定量。提取到的NETs吹打均勻，取等量的樣本誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，并分別加入D

3、Nase拮抗及肝素干預(yù)，37℃孵育6h，應(yīng)用MTT法測定各組臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的活性，評估內(nèi)皮細(xì)胞的損傷程度以及肝素對內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：
　　PMA刺激PMN可產(chǎn)生NETs，免疫熒光染色顯示在PMN周圍形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，應(yīng)用picogreen熒光酶標(biāo)儀檢測到加入PMA刺激的PMN組比對照組上清液中cfDNA/NETs的濃度增加（P＜0.05）。應(yīng)用NETs誘導(dǎo)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，可見到內(nèi)皮細(xì)胞活性明顯被抑制，且隨著NETs

4、濃度的增加（10ng/ml、20ng/ml、30ng/ml），內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞抑制率逐漸上升，與對照組相比差異顯著(10.896％、17.352％、28.125％，P＜0.05)。加入DNase后，NETs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞活性降低可被拮抗，進(jìn)一步證明內(nèi)皮細(xì)胞活性降低的原因是由于NETs的損傷作用。在NETs誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷后，分別加入不同濃度的肝素（0.01U/mL、0.1 U/mL、1.0U/mL、10U/mL）干預(yù)，應(yīng)用MTT法檢測內(nèi)皮細(xì)