激活TRPV1誘導自噬在血管平滑肌細胞泡沫化中作用及機制研究.pdf

1、背景和目的:
　　動脈粥樣硬化形成以泡沫細胞在血管壁上沉積為特征性病理表現。泡沫細胞的增多促進了粥樣斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定性，導致心腦血管事件的發(fā)生。動脈粥樣硬化是心腦血管疾病的首要致病因素。泡沫細胞的主要來源是單核巨噬細胞和血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)。早期動脈粥樣硬化病變中的泡沫細胞主要來源于巨噬細胞，而中晚期病變中泡沫細胞主要來源于VSMC（45％為VSMC來源，只有30％

2、呈現巨噬細胞標記）。相比于巨噬細胞性泡沫細胞形成的大量研究，來源于VSMC的泡沫細胞在近年才受到關注，其形成的具體調控機制還遠未闡明。
　　泡沫細胞的形成是由于胞漿內出現大量含膽固醇酯核心的脂滴而使得細胞呈現類似泡沫樣的外觀改變。以往認為脂滴的代謝主要在胞漿內進行，由系列脂肪水解酶（如脂肪甘油三酯脂肪酶和單?；视椭久傅龋ζ浜诵闹|進行分解。最近的研究證實，自噬介導的溶酶體內降解也是脂滴分解的重要途徑。尤其是在動脈粥樣硬化這個

3、高脂環(huán)境中，自噬介導的脂滴分解可能較傳統(tǒng)的胞漿分解途徑起著更為重要的作用。更為直接的證據是在巨噬細胞源性泡沫細胞中，自噬通過溶酶體酸性脂肪酶調節(jié)膽固醇外流。抑制自噬會增加而誘導自噬會降低細胞內脂質的聚集。但是，目前少有研究報道自噬在VSMC泡沫樣變過程中的作用。
　　瞬時受體電位香草醛亞家族1(transient receptor potential vanilloid subfamily1，TRPV1)可被辣椒素激活。TRPV1

4、是非選擇性陽離子通道并且對心腦血管疾病具有保護作用。以往研究顯示TRPV1的激活可以通過減少脂質的攝取和增加脂質的轉出而抑制VSMC泡沫樣變。最近研究表明TRPV1的激活可以誘導肝細胞和胸腺細胞的自噬水平。此外，TRPV1的激活以后可以進一步促進腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase，AMPK)磷酸化，而后者在自噬的調控中發(fā)揮促進作用。我們設想，TRPV1的激活可以通過促進AMPK的磷酸化而誘導自噬，

5、進而抑制VSMC的泡沫樣變。
　　為了證實我們的假設，本研究分為三部分。第一部分探討自噬在VSMC泡沫樣變過程中的作用。利用氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，oxLDL)誘導原代VSMC泡沫樣變。利用雷帕霉素(rapamycin，Rap)誘導自噬和3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）抑制自噬，探討調控自噬對VSMC泡沫樣變的作用。第二部分分題一在oxLDL誘

6、導的VSMC泡沫樣變模型中加入不同濃度的TRPV1激動劑辣椒素以及利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，探索激活TRPV1對自噬的作用。分題二離體實驗利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，在體實驗利用野生型和TRPV1敲除小鼠喂高脂以及辣椒素，探討激活TRPV1對自噬溶酶體途徑的作用。分題三利用小干擾RNA技術，敲低自噬關鍵基因Atg7，探討自噬在TRPV1抑制VSMC泡沫樣變中的作用。第三部分研究TRPV1激活誘導自噬的可能分子機制。

7、利用野生型和TRPV1敲除的VSMC，oxLDL誘導泡沫樣變，利用AMPK抑制劑compound C，探討激活TRPV1是否通過活化AMPK通路而誘導自噬。
　　材料與方法:
　　離體實驗主要利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主動脈原代培養(yǎng)的VSMC作為研究對象。在體實驗分別利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠隨機分為普高脂組（HFD組）和高脂加辣椒素組（HFD+Cap組）。
　　1.利用組

8、織貼塊法進行原代培養(yǎng)VSMC。
　　2.利用oxLDL刺激VSMC構建泡沫細胞模型。
　　3.采用蛋白免疫印跡的分子生物學技術，探討自噬相關蛋白LC3、beclin-1及p62的變化以判斷自噬水平。
　　4.采用油紅O染色檢測泡沫細胞形成，細胞內膽固醇檢測分析細胞內膽固醇含量。
　　5.利用C57BL/6J野生型和TRPV1-/-小鼠的主動脈進行原代平滑肌細胞的培養(yǎng)，以TRPV1激動劑辣椒素及其特異性拮抗劑作為藥

9、物干預手段，采用蛋白免疫印跡法檢測主動脈及平滑肌細胞上溶酶體相關蛋白LAMP1的變化，采用免疫熒光的方法檢測LAMP1的表達。
　　6.利用轉染siRNA技術，敲低自噬關鍵蛋白Atg7。
　　7.利用AMPK的抑制劑抑制AMPK的活性，檢測Atg7及LC3的表達。
　　結果:
　　1.oxLDL呈濃度梯度地誘導VSMC脂質聚集，80μg/ml最明顯;80μg/ml oxLDL呈時間依賴性地降低LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的

10、比值、beclin-1的蛋白水平以及升高p62的蛋白水平，刺激24小時后變化最明顯。
　　2.自噬誘導劑雷帕霉素可以減少油紅O陽性細胞個數和細胞內總膽固醇的含量，而自噬抑制劑則增加油紅O陽性細胞個數和細胞內膽固醇的含量。
　　3.TRPV1激動劑可呈濃度依賴性地逆轉oxLDL降低的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值和beclin-1的蛋白水平，該作用可被TRPV1拮抗劑或TRPV1-/-所抑制。
　　4.激活TRPV1可增加LA

11、MP1的表達，TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能增加LAMP1的表達。
　　5.激活TRPV1可顯著升高高脂喂養(yǎng)野生型小鼠主動脈LAMP1的表達，而對高脂喂養(yǎng)TRPV1-/-小鼠LAMP1的表達沒有影響。
　　6.在con siRNA轉染的VSMC，TRPV1激動劑可以升高LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值、beclin-1的蛋白水平以及減少油紅O染色陽性細胞數和細胞內膽固醇含量，而對Atg7siRNA轉染的VSMC，T

12、RPV1激動劑則沒有顯示出上述效應。
　　7.激活TRPV1可增加p-AMPK的表達，TRPV1的特異性拮抗劑及TRPV1-/-則不能增加p-AMPK的表達;AMPK抑制劑compound C抑制p-AMPK、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及Atg7的蛋白表達。
　　結論:
　　本研究顯示在oxLDL誘導的VSMC泡沫樣變過程自噬水平是受到抑制的;調控自噬可以調節(jié)VSMC的泡沫樣變;TRPV1的激活可以通過誘導AMPK磷酸