溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究細胞實驗
　　目的:針對課題組在國內(nèi)首次制備具有溫敏特性的殼聚糖衍生物-羥丁基殼聚糖(HBC)水凝膠，通過該材料在體外對成纖維細胞及血管內(nèi)皮細胞生長影響的研究，探討該材料的細胞學行為，為材料的最終臨床應用提供細胞學實驗依據(jù)。
　　方法:1.HBC浸提液對小鼠成纖維細胞(L929)的影響于37℃下將HBC水凝膠浸提于DMEM培養(yǎng)液24小時得浸

2、提液。設(shè)置陰性對照組、苯酚陽性對照組及25％、50％、75％、100％濃度浸提液四個實驗組，設(shè)3塊96孔培養(yǎng)板，10孔平行對照組，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。于1天、2天、4天后在倒置顯微鏡下觀察L929細胞生長情況，通過MTS法測定吸光度OD值，計算出不同組細胞的存活率。將L929細胞分別用陰性對照液、50％HBC浸提液及100％HBC浸提液進行培養(yǎng)，3天后用流式細胞學的方法檢測L929細胞凋亡情況。
　　2.HBC浸提液對

3、人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人肺成纖維細胞(HLF)的影響設(shè)25％、50％、75％、100％HBC浸提液4個實驗組和陰性對照組，將人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)和人肺成纖維細胞(HLF)在96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每個實驗孔內(nèi)加入100μl待測液，設(shè)3塊96孔培養(yǎng)板，10孔平行對照組，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1天、2天、4天后在倒置顯微鏡下觀察兩種細胞的生長情況，通過MTS法測定HUVEC細胞的吸光度OD值，計算出不同濃

4、度組HUVEC細胞的存活率。
　　結(jié)果:在HBC浸提液L929細胞毒性實驗中，25％、50％和75％、100％濃度的浸提培養(yǎng)液組及陰性對照組細胞死亡情況較苯酚陽性對照組有顯著差異(P＜0.001)，HBC浸提液可明顯抑制L929細胞的生長，促進其凋亡。流式細胞學檢測:HBC浸提液可以將L929細胞部分阻礙在G1期向S期分化過程中(P＜0.05)，驗證了其凋亡存在性。HBC浸提液對HUVEC無細胞毒性，且100％浸提液對于HUVEC

5、細胞較陰性對照組有輕度促進生長作用(P＜0.001)。通過觀察發(fā)現(xiàn)第4天HLF細胞也出現(xiàn)了與L929細胞相似的凋亡細胞學形態(tài)。
　　結(jié)論:溫敏性羥丁基殼聚糖（HBC）未發(fā)現(xiàn)明顯的細胞毒性，可促進血管內(nèi)皮細胞的生長，但對成纖維細胞有一定的抑制作用。
　　第二部分 溫敏性羥丁基殼聚糖生物安全性研究動物實驗
　　目的:本研究使用羥丁基殼聚糖(HBC)，研制出一種新型可原位注射、溫敏性凝膠系統(tǒng)。通過動物體內(nèi)急性毒性實驗、致熱原

6、實驗、皮內(nèi)刺激實驗、免疫毒性實驗等，初步評價該材料的生物安全性，為材料的最終臨床應用提供動物實驗依據(jù)。
　　方法:1.急性毒性實驗將HBC水凝膠在生理鹽水下浸提24小時后，濾去沉淀，得到HBC生理鹽水浸提液。將清潔級健康SD大鼠隨機分為實驗組及對照組，每組各5只，通過尾緣靜脈以0.1mL/s的速度、50mL/kg的劑量注射入實驗組大鼠體內(nèi)，觀察大鼠死亡情況。
　　2.致熱原實驗通過耳緣靜脈將上述HBC生理鹽水浸提液以0.1m

7、L/s的速度、2.5mL/kg的劑量注射入7只清潔級新西蘭兔體內(nèi)后，觀察體溫變化情況。
　　3.皮內(nèi)刺激實驗將4種不同的待測液（100％HBC浸提液、50％ HBC浸提液、生理鹽水、苯酚溶液）通過皮內(nèi)注射入5只清潔級新西蘭兔的背部，觀察其皮膚改變情況。
　　4.免疫毒性實驗將80只大鼠隨機分為低、中、高劑量組和對照組，腹腔給藥2周，每周2次，恢復周期14天，檢測大鼠血清免疫學指標后進行比較。取大鼠股骨骨髓組織，用吉姆薩染液染

8、色后觀察骨髓涂片。
　　結(jié)果:HBC浸提液注入SD大鼠體內(nèi)一周后未引起大鼠死亡及不適，急性毒性實驗結(jié)果為陰性。將HBC浸提液注射入新西蘭兔體內(nèi)未引起實驗動物體溫升高，致熱原實驗結(jié)果為陰性。將HBC浸提液注射入新西蘭兔背部皮膚，實驗組皮膚刺激反應與陰性生理鹽水組相似，無明顯皮膚顏色改變，而與陽性對照組有顯著性差異。血清免疫學實驗中發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白IgA、IgG、補體C3、殺傷型(CD3+CD8+)T細胞等檢測指標有統(tǒng)計學差異（P值＜0