TLR4介導的信號通路對肝細胞凋亡的影響及氧化苦參堿的干預機制研究.pdf

1、第一部分 TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號通路對大鼠肝BRL-3A細胞凋亡的影響
　　目的：
　　探討大鼠肝BRL-3A細胞中是否有Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）介導的PI3K/AKT/GSK3β信號通路，及該通路在BRL-3A細胞凋亡中的作用與機制，為急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）的預防和治療提供新的靶點。
　　方法：
　　采用大鼠肝

2、BRL-3A細胞，運用脂多糖（lipopolsaccharide，LPS）建立肝細胞凋亡模型。分別應用TLR4抑制劑（CLI-095）、PI3K/AKT抑制劑（LY294002）和GSK3β抑制劑（LiCl）預處理BRL-3A細胞，以減弱或加強TLR4/PI3K/AKT/GSK3β信號轉導通路的作用。CCK-8法檢測細胞活力；流式細胞術（Flow cytometry，FCM）檢測細胞凋亡率；Hoechst33342染色法觀察LPS刺激及

3、TLR4抑制劑阻斷后細胞凋亡的形態(tài)；Western-blot法檢測BRL-3A細胞內AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、Bax、Bcl-2及active-caspase-3蛋白的表達；實時定量PCR法（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測BRL-3A細胞內Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA的表達；免疫熒光法觀察GSK3β核易位情況。
　　結果：

4、r>　?。?）CCK-8法結果顯示，LPS（10μg/ml）刺激BRL-3A細胞不同時間（1、3、6、12、24 h）后，細胞活力均明顯低于對照組（P<0.05），LPS作用于BRL-3A細胞24 h后其活力為對照組的58％（P<0.05）。
　　（2）Hoechst33342染色法結果顯示，LPS刺激后，隨著刺激時間的延長，BRL-3A細胞凋亡增多，并出現壞死細胞，刺激24 h可見細胞核碎片和核固縮。TLR4抑制劑（CLI-09

5、5）預處理組凋亡細胞明顯減少，未見凋亡小體。
　?。?）流式細胞術結果顯示，LPS（10μg/ml）刺激BRL-3A細胞不同時間（1、3、6、12、24 h）后，細胞凋亡率逐漸上升（P<0.01），24 h BRL-3A細胞凋亡率達68.30%。與 LPS組比較，CLI-095+ LPS組可以減少 LPS刺激引起的 BRL-3A細胞凋亡率（P<0.05）；LY294002+LPS組細胞凋亡率增加（P<0.05）；LiCl+LPS組

6、細胞凋亡率下降（P<0.05）。
　?。?）Western-blot法結果顯示，正常對照組BRL-3A細胞中有AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9的表達；LPS組P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達低于正常對照組（P<0.05）；與LPS組比較，CLI-095+LPS組P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達有所上調；而LY294002+LPS組的P-AKTSer473和P

7、-GSK3βSer9表達下調（P<0.05）；LiCl+LPS組P-GSK3βSer9的表達上調（P<0.05）。
　?。?）免疫熒光法檢測GSK3β核易位結果顯示，正常對照組中GSK3β主要表達在BRL-3A細胞質中；LPS組GSK3β大多易位到胞核；與LPS組比較，CLI-095、LiCl預處理組GSK3β核易位均不同程度減弱，LY294002預處理組GSK3β核易位作用增強。
　　（6）RT-qPCR法檢測結果顯示，與

8、正常對照組比較，LPS組 Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA的表達均上調（P<0.05）；與LPS組比較，CLI-095+LPS組及LiCl+LPS組Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達降低（P<0.05）；LY294002+LPS組Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達上調（P<0.05）。
　　（7）Western-blot法測定結果顯示，與正常對照組比較，LPS組 Bax/Bcl-

9、2及active-caspase-3表達均上調（P<0.05）。與LPS組比較，CLI-095+LPS組及LiCl+LPS組Bax/Bcl-2及active-caspase-3表達降低（P<0.05）；LY294002+ LPS組Bax/Bcl-2及active-caspase-3表達上調（P<0.05）。
　　結論：
　　（1）BRL-3A細胞中有TLR4介導的PI3K/AKT/GSK3β信號通路。
　　（2）BRL

10、-3A細胞 TLR4激活后，P-AKTSer473和 P-GSK3βSer9表達下調，使Bax/Bcl-2及active-caspase-3的表達增加，細胞凋亡率升高。BRL-3A細胞凋亡過程中有TLR4介導的PI3K/AKT/GSK3β信號通路的參與。
　　第二部分 TLR4/P38/JNK信號通路對大鼠肝BRL-3A細胞凋亡的影響
　　目的：
　　探討大鼠肝BRL-3A細胞中是否有TLR4介導的P38/JNK信號通

11、路，及該通路在BRL-3A細胞凋亡中的作用與機制，為急性肝衰竭的預防和治療提供新的靶點。
　　方法：
　　采用大鼠肝BRL-3A細胞，應用LPS建立肝細胞凋亡模型。分別運用TLR4抑制劑（CLI-095）、P38抑制劑（SB203580）、JNK抑制劑（SP600125）及 ERK抑制劑（FR180204）預處理BRL-3A細胞，以影響TLR4/P38/JNK信號轉導通路的作用。流式細胞術檢測細胞凋亡率；Western-bl

12、ot法檢測BRL-3A細胞內JNK、P-JNK、P38、P-P38、Bax、Bcl-2及active-caspase-3蛋白的表達； RT-qPCR檢測大鼠肝細胞Bax、Bcl-2及caspase-3 mRNA的表達。
　　結果：
　　（1）流式細胞術結果顯示，LPS組細胞凋亡率高于正常對照組（P<0.05）；而CLI-095+LPS組、SB203580+LPS組、SP600125+LPS組細胞凋亡率顯著低于LPS組（P<0

13、.05）；FR180204+LPS與LPS組比較無明顯差異。
　　（2）Western-blot結果顯示，LPS組 P-P38，P-JNK表達明顯高于正常對照組（P<0.05）；CLI-095+LPS組、SB203580+LPS組、SP600125+LPS組P-P38，P-JNK表達顯著低于LPS組（P<0.05）；FR180204+LPS組與LPS組比較無明顯差異。
　?。?）RT-qPCR結果顯示，LPS組Bax/Bcl

14、-2及caspase-3 mRNA明顯高于正常對照組（P＜0.05）；CLI-095+LPS組、SB203580+LPS組和SP60012+LPS組Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達均顯著低于LPS組（P<0.05）；FR180204+LPS組Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達無明顯變化。
　?。?）Western-blot結果顯示，LPS組Bax/Bcl-2及active-caspase-3表

15、達比正常對照組高（P<0.05）；CLI-095+LPS組、SB203580+LPS組和SP60012+LPS組Bax/Bcl-2及active-caspase-3表達顯著低于LPS組（P<0.05）；FR180204+ LPS組與LPS組比較無明顯差異。
　　結論：
　　（1）BRL-3A細胞中有TLR4介導的P38/JNK信號通路。
　?。?）BRL-3A細胞TLR4激活后，P-P38、P-JNK表達增加，使Bax

16、/Bcl-2的比例和active-caspase-3表達增加，從而促進BRL-3A細胞的凋亡。BRL-3A細胞凋亡過程中有TLR4介導的P38/JNK信號通路的參與。
　　第三部分氧化苦參堿對大鼠肝BRL-3A細胞凋亡的抑制作用及其機制研究
　　目的：
　　探討氧化苦參堿（Oxymatrine，OMT）對 LPS誘導的大鼠肝 BRL-3A細胞凋亡的抑制作用及其機制，為 OMT抑制肝細胞凋亡提供更多的實驗依據。
　

17、　方法：
　　采用 LPS誘導大鼠肝 BRL-3A細胞建立細胞凋亡模型。應用 CCK-8法測定 OMT對 BRL-3A細胞活力的影響；生物化學法測定不同劑量 OMT對 LPS誘導的 BRL-3A細胞乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放率的影響。根據 LDH釋放率選擇OMT濃度為0.75、1.5、3.0 g/L進行后續(xù)實驗。然后實驗分5組：正常對照組，LPS組，OMT低劑量+LPS組，OMT中劑量+L

18、PS組，OMT高劑量+LPS組。Hochest33342染色觀察細胞凋亡形態(tài)；流式細胞儀檢測細胞凋亡率；RT-qPCR法檢測BRL-3A細胞中Bax、Bcl-2、caspase-3 mRNA的表達；Western-blot法檢測BRL-3A細胞中AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、P38、P-P38、JNK、P-JNK、Bax、Bcl-2和 active-caspase-3蛋白的表達；免疫熒光觀察GSK3

19、β核易位情況。
　　結果：
　?。?）不同劑量的（0.375～6.0 g/L）OMT和 BRL-3A細胞共培養(yǎng)24 h，BRL-3A細胞生長狀態(tài)良好。
　?。?）LPS刺激 BRL-3A細胞后，LDH釋放率增加（P<0.01），而OMT預處理后能明顯降低 LDH的釋放率（P<0.05或 P<0.01）。
　?。?）CCK-8法結果顯示，LPS組細胞活力明顯降低（P<0.05），OMT預處理可以明顯減弱由 LPS引

20、起的細胞活力降低（P<0.05或 P<0.01）。
　　（4）流式細胞術結果顯示：LPS組 BRL-3A細胞凋亡率明顯高于正常對照組（P<0.05），OMT預處理可以顯著降低由 LPS刺激引起 BRL-3A細胞凋亡率的增加（P<0.05）。
　?。?）Hochest33342染色結果顯示，LPS組可見 BRL-3A細胞凋亡增多，OMT預處理后凋亡細胞明顯減少。
　?。?）Western-blot檢測結果顯示，LPS組

21、TLR4表達增加（P<0.05），P-AKTSer473和 P-GSK3βSer9表達降低（P<0.05），P-P38、P-JNK表達增加（P<0.05）；與 LPS組比較，OMT中、高劑量預處理可以下調 TLR4的表達，并上調 P-AKTSer473和 P-GSK3βSer9的表達（P<0.05），下調 P-P38、P-JNK的表達（P<0.05或P<0.01）。
　?。?）免疫熒光結果顯示，OMT預處理能明顯減少 LPS刺激引

22、起的 GSK3β核易位。
　　（8）RT-qPCR結果顯示，LPS組 Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達明顯增高（P<0.05）。與 LPS組比較，OMT預處理能明顯降低由 LPS誘導的 BRL-3A細胞中 Bax/Bcl-2及caspase-3 mRNA表達上調（P<0.05或 P<0.01）。
　?。?）Western-blot結果顯示，OMT預處理能明顯降低由 LPS誘導的 BRL-3A細胞中 Bax

23、/Bcl-2及active-caspase-3表達上調（P<0.05）。
　　結論
　?。?）OMT預處理可以顯著降低由LPS誘導的BRL-3A細胞凋亡。
　?。?）OMT能上調經LPS刺激的BRL-3A細胞P-AKTSer473和P-GSK3βSer9水平，減少LPS刺激引起的GSK3β核易位，降低經LPS激活的P38和JNK磷酸化水平，下調Bax/Bcl-2的比例和active-caspase-3的表達，從而明顯抑

24、制BRL-3A細胞凋亡。
　?。?）OMT通過TLR4/PI3K/AKT/GSK3β及TLR4/P38/JNK信號通路抑制BRL-3A細胞凋亡。
　　第四部分氧化苦參堿對急性肝衰竭大鼠肝細胞凋亡的抑制作用及其機制研究
　　目的：
　　探討氧化苦參堿（OMT）對LPS/D-GalN誘導的急性肝衰竭大鼠肝細胞凋亡的抑制作用及其機制，為臨床防治急性肝衰竭抑制肝細胞凋亡尋找有效的藥物。
　　方法：
　　采用L

25、PS/D-GalN建立大鼠急性肝衰竭模型。100只大鼠隨機分為5組：正常對照組，模型組，OMT低、中、高劑量組。應用HE染色光鏡觀察肝臟病理學改變；透射電鏡觀察細胞凋亡情況；全自動生化分析儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平；ELISA法測定各組大鼠外周血腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis

26、 factor，TNF-α）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）水平；流式細胞術測定各組大鼠肝細胞凋亡率；Western-blot檢測肝組織中AKT、P-AKTSer473、GSK3β、P-GSK3βSer9、P38、P-P38、JNK、P-JNK、Bax、Bcl-2和active-caspase-3的表達。免疫組化 S-P法觀察肝組織TLR4、Bax、Bcl-2和 active-caspase-3的表達；

27、　　結果：
　?。?）各組大鼠死亡率及肝臟大體情況，正常對照組和 OMT低、中、高劑量組無大鼠死亡；模型組大鼠死亡率達30%。模型組可見肝臟大體腫脹明顯，表面彌漫出血，大片瘀斑，呈暗紅色，OMT低、中、高劑量組肝臟大體不同程度的好轉。
　?。?）HE染色見模型組肝細胞明顯壞死，大片狀壞死和出血，僅少量肝細胞殘存，散在分布，無正常肝小葉結構，纖維網狀支架塌陷，匯管區(qū)大量炎癥細胞浸潤。透射電鏡顯示模型組肝細胞壞死明顯，形態(tài)不規(guī)則

28、，可見核皺縮和核碎裂，見凋亡小體，肝細胞內線粒體嚴重損害，無明顯細胞器結構。OMT各劑量預處理可不同程度改善肝組織病理損傷。
　?。?）生化分析儀測定結果顯示，模型組大鼠外周血 AST、ALT的水平明顯高于正常對照組（P<0.05），OMT各劑量組，AST、ALT的水平顯著低于模型組（P<0.05）。
　?。?）ELISA法結果顯示，模型組大鼠外周血 TNF-α和 IL-1β水平明顯高于正常對照組（P<0.01），OMT各劑

29、量組，TNF-α和 IL-1β水平顯著低于模型組（P<0.05或P<0.01）。
　?。?）流式細胞術結果顯示，模型組肝細胞凋亡率明顯增加（P<0.05），與模型組比較，OMT中、高劑量預處理可以降低肝細胞凋亡率（P<0.05）。
　?。?）Western-blot法結果顯示，模型組TLR4表達增加（P<0.05），P-AKTSer473和P-GSK3βSer9表達降低（P<0.05），P-P38、P-JNK表達增加（P<0

30、.05）；與模型組比較，OMT中、高劑量預處理可以下調 TLR4的表達（P<0.05），并上調P-AKTSer473和 P-GSK3βSer9的表達（P<0.05），下調 P-P38、P-JNK的表達（P<0.05）。
　　（7）Western-blot法檢測Bax/Bcl-2比例和 active-caspase-3蛋白結果顯示，模型組 Bax/Bcl-2比例和 active-caspase-3蛋白的表達明顯高于正常對照組（P<0

31、.05）。與模型組比較，OMT預處理可下調 Bax/Bcl-2比例和active-caspase-3蛋白的表達（P<0.05）。
　?。?）免疫組化法結果顯示，模型組 TLR4、Bax、active-caspase-3表達明顯增高，Bcl-2的表達較正常對照組有所下降（P<0.05）。與模型組比較，OMT預處理可下調 TLR4、active-caspase-3及 Bax的表達，上調 Bcl-2的表達（P<0.05）。
　　結

32、論：
　?。?)OMT預處理能改善LPS/D-GalN誘導的急性肝衰竭大鼠肝組織病理損傷，明顯降低血清轉氨酶，保護肝細胞。
　?。?）OMT能降低急性肝衰竭大鼠肝組織 TLR4的表達、上調 P-AKTSer473和P-GSK3βSer9的表達，下調 GSK3β表達；下調 P-P38、P-JNK的表達，使TNF-α和IL-1β水平降低，下調 Bax/Bcl-2比例和 active-caspase-3蛋白的表達，從而明顯抑制肝細