沉默HMGA2對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞的影響及與Notch1表達(dá)的關(guān)系并肺癌患者臨床病例特點(diǎn)分析.pdf

1、目的:HMGA2蛋白是一種結(jié)構(gòu)性轉(zhuǎn)錄因子，能夠正性、負(fù)性調(diào)節(jié)許多基因的轉(zhuǎn)錄。HMGA2并未直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，而是通過AT-hook與DNA結(jié)合，改變DNA的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，或者是直接與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，改變轉(zhuǎn)錄活性。利用小于擾RNA(siRNA)技術(shù)在肺腺癌A549細(xì)胞中沉默HMGA2，觀察沉默該基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)、凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其對(duì)Notch信號(hào)通路分子Notch1表達(dá)的影響，探討HMGA2對(duì)Notch信號(hào)通路的影響。分析180例肺

2、癌患者的病例特點(diǎn)，探討肺癌發(fā)病情況的變化及免疫組化指標(biāo)在肺癌臨床診治的作用。
　　方法:化學(xué)合成HMGA2的siRNA，應(yīng)用脂質(zhì)體2000將siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)肺腺癌A549細(xì)胞。利用實(shí)時(shí)熒光定量QRT-PCR技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)HMGA2基因表達(dá)下降的情況及Notch1基因表達(dá)變化。應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫印跡法(westernblot)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞HMGA2蛋白、Notch1蛋白表達(dá)的變化。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后在相差顯微鏡下觀察

3、細(xì)胞形態(tài)變化。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率的變化。應(yīng)用CCK8檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖率的變化。對(duì)我院胸外科2015年1月至2015年6月手術(shù)治療后病理確診的肺癌患者病歷進(jìn)行回顧性分析，采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　結(jié)果:(1)用帶熒光標(biāo)記的siRNA轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)到的轉(zhuǎn)染率為95％，表明siRNA可成功轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。(2)將化學(xué)合成的siRNA轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞48小時(shí)后觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞回縮

4、，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞之間空隙增大。(3)QRT-PCR分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后HMGA2與Notch1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后siRNA鏈1的HMGA2的表達(dá)下降67％以上，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染組Notch1的表達(dá)下降，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。轉(zhuǎn)染組Notch1的表達(dá)與陰性對(duì)照組比較下降了約60％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(4)Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后細(xì)胞HMGA2蛋白和Notch1蛋白表達(dá)變化，結(jié)果示轉(zhuǎn)染siRNA能夠成功

5、下調(diào)A549細(xì)胞中HMGA2的蛋白表達(dá)，同時(shí)觀察到siRNA-HMGA2轉(zhuǎn)染組Notch1蛋白表達(dá)水平的下降。(5)應(yīng)用CCK8方法檢測(cè)沉默HMGA2對(duì)細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果示siRNA沉默HMGA2基因后A549細(xì)胞增殖率降低。(6)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染72小時(shí)后細(xì)胞凋亡率較對(duì)照組升高。(7)180例肺癌患者中腺癌所占構(gòu)成比為66.7％，高于鱗狀細(xì)胞癌9.4％。在男性患者中腺癌所占比例(51.4％)也大于鱗癌(21.6％)。(8