神經降壓素NTS及其受體NTSR1對膠質瘤細胞增殖的影響及其分子機制.pdf

1、惡性膠質瘤是具有高度侵襲性和致死性的顱內原發(fā)性腫瘤，約占成人顱內原發(fā)惡性腫瘤的80％。盡管近年來綜合治療策略（聯合手術、放療和化療）在臨床中的廣泛運用并取得了一定效果，但多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者的中位生存期仍然少于15個月。惡性增殖是膠質瘤細胞的生物學特點之一，導膠質瘤細胞惡性增殖的重要原因是腫瘤細胞基因組的不穩(wěn)定和功能基因組的異常表達。因此，深入探討膠質細胞增殖和腫瘤生長的分子機

2、制將有助于解釋其惡性增殖現象。
　　神經降壓素(neurotensin，NTS)是由13個氨基酸殘基組成的直鏈多肽，作為神經遞質和激素樣神經肽廣泛分布并作用于中樞神經系統和消化系統。研究發(fā)現，神經降壓素和高親和力受體1(neurotensin receptor1，NTSR1)在多種腫瘤的病理進程中發(fā)揮了重要作用。因此，NTS/NTSR1有望成為腫瘤治療的潛在靶點，但目前尚無文獻報道NTS/NTSR1在惡性膠質瘤中的生物學效應及其分

3、子機制。
　　微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一類內源性、短鏈、高度保守的非編碼RNA。miRNAs和相應蛋白形成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC作用于靶點mRNA的3端非轉錄區(qū)，以轉錄后調節(jié)方式抑制靶點mRNA翻譯成蛋白質或降解該mRNA。生物信息學分析發(fā)現人體約有30％-60％基因的表達受到微小RNA的調控，其中包括眾多細胞周期調控因子。<

4、br>　　本研究采用體外和體內實驗觀察NTS/NTSR1、miRNAs和c-Myc對膠質瘤細胞增殖、細胞周期和移植瘤生長的影響;采用miRNAs芯片、熒光定量PCR和染色質免疫共沉淀(ChIP)實驗論證NTS/NTSR1如何調控miRNAs的表達;采用熒光素酶報告基因和正反論證法觀察miRNAs和CDKs之間的關聯;采用western blot、熒光定量PCR和正反論證法探討NTS/NTSR1如何調控CDK4的表達。旨在探討NTS/NT

5、SR1在膠質瘤細胞增殖中的生物學作用及其分子機制，為研究控制膠質瘤生長和改善患者預后提供實驗依據和新的治療靶點。
　　主要結果:
　　1.NTS/NTSR1促進膠質瘤細胞增殖、G1/S期進展和皮下移植瘤生長
　　NTS在體外具有促進膠質瘤細胞增殖和G1/S期進展的能力，而使用NTSR1的特異性拮抗劑SR48692或siNTSR1可以顯著逆轉NTS對細胞增殖和細胞周期進展的促進作用;沉默膠質瘤細胞NTSR1的表達可以顯著

6、抑制皮下移植瘤的生長;NTS/NTSR1對膠質瘤細胞增殖的影響主要通過調控G1/S期進展而不是通過影響細胞凋亡;NTS/NTSR1對G1/S期進展的促進作用主要通過在轉錄后水平調節(jié)CDK6的表達，在轉錄水平調節(jié)CDK4表達來實現。
　　2.NTS/NTSR1通過c-Myc/miR-29b-1和miR-129-3p調節(jié)CDK6蛋白的表達
　　NTS/NTSR1抑制膠質瘤細胞中miR-29b-1和miR-129-3p的表達，這兩

7、個miRNAs均可以作用于CDK6 mRNA的3端非轉錄區(qū)并抑制CDK6蛋白的表達;NTS/NTSR1通過促進轉錄因子c-Myc的表達繼而作用于miR-29b-1的啟動子并抑制其表達。
　　3.NTS/NTSR1通過轉錄因子c-Myc在轉錄水平促進CDK4的表達
　　NTS促進膠質瘤細胞中轉錄因子c-Myc的表達，該過程需要NTSR1的參與;轉錄因子c-Myc通過和CDK4的啟動子結合繼而促進CDK4的轉錄表達。
　　

8、4.miR-29b-1、miR-129-3p和轉錄因子c-Myc影響膠質瘤細胞增殖、G1/S期進展、顱內原位移植瘤生長和荷瘤裸鼠生存時間
　　miR-29b-1和miR-129-3p抑制膠質瘤細胞增殖和G1/S期進展;在U87-NTSR1-SH細胞中干擾miR-29b-1和miR-129-3p的功能可以恢復顱內原位移植瘤的生長;在U87-NTSR1-SH細胞中過表達c-Myc或干擾miRNAs的功能均可以促進膠質瘤細胞增殖和G1/

9、S期進展，兩者聯合運用具有協同促進作用。
　　綜上所述，NTS/NTSR1可以在體外促進膠質瘤細胞增殖和G1/S期進展，在體內促進腫瘤組織的生長，而沉默NTSR1可以逆轉上述現象;NTS/NTSR1通過抑制miR-29b-1和miR-129-3p表達繼而解除這兩個miRNAs對CDK6蛋白表達的抑制作用;NTS/NTSR1通過促進c-Myc表達一方面抑制miR-29b-1的表達，另一方面促進CDK4的轉錄;NTS/NTSR促進膠質