磁刺激通過PEA-15對星形膠質(zhì)細胞遷移的影響及機制.pdf

1、背景及目的：
　　星形膠質(zhì)細胞磷酸化蛋白PEA-15（Phosphoprotein enriched in astrocytes-15kDa）廣泛存在于細胞質(zhì)，位于常染色體Iq21-22，其含有一個DED結(jié)構(gòu)域（death effector domain,DED）死亡效應區(qū)，抑制細胞凋亡。ERK1/2（Extracellular signal-regulated kinases）參與細胞增殖、存活和細胞遷移等多種細胞進程。磁刺激可

2、通過激活ERK通路，促進星形膠質(zhì)細胞的遷移，并對中樞神經(jīng)損傷后的炎癥反應等起到重要的神經(jīng)保護作用。PEA-15通過結(jié)合ERK1/2阻止其在細胞核中聚集，調(diào)控EKR1/2功能，其與磁刺激對星形膠質(zhì)細胞的遷移作用密切相關(guān)。本研究主要是在體外實驗中觀察磁刺激是否可通過調(diào)節(jié)PEA-15影響ERK1/2通路，調(diào)控星形膠質(zhì)細胞的遷移作用，并探討其作用機制。
　　資料與方法：
　　1.星形膠質(zhì)細胞的提取、培養(yǎng)、細胞免疫熒光鑒定：解剖新生1

3、-3天SD(Sprague-Dawley)大鼠獲取大腦皮質(zhì)組織，運用差速貼壁技術(shù)分離培養(yǎng)，獲取星形膠質(zhì)細胞，并觀察其形態(tài)及生長，然后應用免疫熒光技術(shù)鑒定GFAP蛋白的表達。
　　2.實驗分組：體外劃痕試驗，根據(jù)不同的磁刺激強度將實驗分為3組：
　?、賹φ战M（不給予磁刺激，但細胞同其他刺激組置于同一環(huán)境中）；
　?、贏組（給予30％最大磁刺激強度）；
　?、跙組（給予60%最大磁刺激強度）。
　　3.干擾PE

4、A-15表達后劃痕試驗實驗分組：
　　①A組（不給予磁刺激，進行陰形siRNA轉(zhuǎn)染）；
　?、贐組（不給予磁刺激，但對細胞進行PEA-15 siRNA轉(zhuǎn)染，干擾PEA-15表達）；
　?、跜組（給予磁刺激，進行陰性siRNA轉(zhuǎn)染）；
　?、蹹組（給予磁刺激，同時進行siRNA轉(zhuǎn)染，干擾PEA-15表達）。觀察劃痕愈合情況，并運用Western Blot觀察PEA-15及其蛋白磷酸化的表達變化。利用熒光測定轉(zhuǎn)染效率

5、；Western Blot半定量測定干擾效果。
　　結(jié)果：
　　1.從新生1-3天大鼠腦皮質(zhì)中提取，經(jīng)差速貼壁分離、培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞，細胞免疫熒光鑒定膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP表達陽性，DAPI染核測定細胞純度較高。
　　2.在體外劃痕實驗中發(fā)現(xiàn)，隨著磁刺激強度的增加，劃痕面積愈合越快，在30%-60%最大磁刺激強度的強度下，星形膠質(zhì)細胞遷移速度和強度呈正相關(guān)，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　

6、　3.通過細胞轉(zhuǎn)染熒光提示該轉(zhuǎn)染試劑具有較高的轉(zhuǎn)染效率，對轉(zhuǎn)染細胞進行PEA-15蛋白的測定，Western Blot結(jié)果提示siRNA270具有最佳的干擾效果。劃痕實驗中轉(zhuǎn)染組與磁刺激組均較正常組遷移明顯。磁刺激組的P-PEA-15增加明顯。
　　結(jié)論：
　　1.差速貼壁結(jié)合搖床方法可培養(yǎng)純度較高的高星形膠質(zhì)細胞。
　　2.體外劃痕實驗中，在磁刺激30%-60%的強度下可明顯促進星形膠質(zhì)細胞的遷移。
　　3.干