硫酸長春新堿長循環(huán)熱敏脂質體的研究.pdf

1、背景1962年，Beer等從長春花中提取并分離得到了長春堿（vinblastine,VLB）和長春新堿（vincristine,VCR），經過不斷探索研究，人們已從長春花中分離得到70多種生物堿，臨床常用的該類藥物有長春堿（VLB）、長春新堿（VCR）以及半合成的長春瑞濱（vinorebine, VRB）和長春地辛(vindesine，VDS)。通過研究發(fā)現(xiàn)，長春新堿在該類藥物中抗腫瘤活性最強，具有很強的微管蛋白結合能力，同時還能抑制R

2、NA多聚酶活性并干擾蛋白質合成，能夠很好抑制腫瘤細胞增殖。主要用于治療何杰金及非何杰金淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病,也用于胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌、軟組織肉瘤、支氣管肺癌及神經母細胞瘤等惡性腫瘤，此外長春新堿也用于治療血小板減少性紫癜。長春新堿有很強的細胞毒作用，缺乏選擇性，在臨床應用中所導致的消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經系統(tǒng)等藥物不良反應（ADR）事件也較為常見，所以臨床常常采用聯(lián)合用藥的方式來降低長春新堿的使用劑量，這是限制其發(fā)揮效應的

3、重要因素。
　　脂質體（liposome）是以磷脂為主要材料，組成的囊泡狀結構，與細胞膜相似，具有磷脂雙分子層，通過該結構能夠實現(xiàn)脂溶性和水溶性藥物包載，借助這一載體能夠實現(xiàn)藥物靶向遞送，降低潛在毒性，提升藥物穩(wěn)定性。長循環(huán)熱敏脂質體（Long circulation thermosensitive liposome，LTSL）在普通脂質體的基礎上常使用PEG進行修飾（如常用的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，DSPE-PE

4、G2000），增大空間位阻，降低了脂質體與血漿蛋白的結合，避免網狀內皮系統(tǒng)（RES）的捕捉和吞噬，延長了脂質體在體內的循環(huán)時間，同時PEG的引入也能夠防止脂質體自身的聚集，提高制劑的穩(wěn)定性。其中，溫度敏感性磷脂的應用，使脂質體能夠在特定的相變溫度（Tm）將藥物釋放到加熱部位。當達到該溫度時，脂質體的磷脂膜由原來緊密的全反式構象（膠晶態(tài)）轉變?yōu)槭杷傻耐崤嬒螅ㄒ壕B(tài)），膜的流動性也隨之大大提高，藥物更容易被釋放出來。通過使用不同的磷脂并調

5、整所占比例能夠制備得到不同相變溫度的熱敏脂質體。研究表明，將少量溶血磷脂（MSPC）引入熱敏脂質體能夠進一步提高其對溫度的敏感性，加速在相變溫度下的狀態(tài)變化，提升釋藥速度。
　　目的制備長春新堿長循環(huán)熱敏脂質體，借助腫瘤EPR效應提高藥物的靶向性，降低常見毒性反應，實現(xiàn)加熱后藥物的快速釋放，提高治療部位藥物濃度。與市售注射用硫酸長春新堿比較，研究其細胞毒性及體內抗腫瘤活性，評價長春新堿熱敏脂質體作為實體腫瘤治療的預期效果及可行性。

6、
　　內容采用薄膜分散法制備空白脂質體，加壓過膜控制粒徑，pH梯度法主動載藥，制備得到長春新堿長循環(huán)熱敏脂質體（VCR-TSL，VTSL）。以外觀、粒徑、含量、包封率、熱敏特性、穩(wěn)定性等為主要評價指標，篩選最優(yōu)的處方工藝。使用高效液相色譜法建立長春新堿的含量及有關物質分析方法，采用超濾離心法測定脂質體包封率。利用透射電子顯微鏡測量并觀察脂質體形態(tài)，采用激光粒度分析儀測定脂質體的粒徑。利用穩(wěn)定性分析儀追蹤長春新堿長循環(huán)熱敏脂質體5個

7、月以上的穩(wěn)定性，同時測定含量、包封率、粒徑等變化。通過MTT法測定體外細胞毒性，激光共聚焦顯微鏡觀察熒光標記（Cou-6）脂質體與細胞的相互作用。進一步建立裸鼠異種移植腫瘤模型，結合體外腫瘤部位加熱，對長春新堿長循環(huán)熱敏脂質體的藥效學及毒性進行初步評價。
　　結果采用DPPC、DSPE-PEG2000、MSPC為磷脂膜材料。通過對水化液，粒徑控制工藝，冷凍保護劑用量和投料方法等進行系統(tǒng)篩選優(yōu)化，確定了以薄膜分散法制備空白脂質體，以

8、0.2M、pH3.0的酒石酸緩沖液為水化液，加壓過膜法控制粒徑以及pH梯度法主動載藥的制備工藝。經過處方優(yōu)化，制備得到的脂質體平均粒徑在90nm左右；在透射電鏡下觀察，可見脂質體的外觀圓整，粒徑大小分布均勻。該工藝制備得到的脂質體藥物包封率能夠達到98％以上；多批樣品制備處方工藝重現(xiàn)性良好。長期試驗表明,脂質體在-20℃條件下放置5個月穩(wěn)定性良好。體外細胞毒性評價說明長春新堿長循環(huán)熱敏脂質體結合加熱可顯著增強細胞毒作用，在給藥后72h脂

9、質體組中，sw620細胞活性均小于5%，PANC細胞活性均小于20%。細胞攝取實驗發(fā)現(xiàn)熱敏脂質體加熱后更易進入腫瘤細胞。體內實驗結果表明,熱敏脂質體結合腫瘤局部加熱，具有良好的腫瘤增值抑制效果，抑瘤率達到了70%以上，同時，高劑量脂質體組裸鼠體重和注射液組無顯著性差異，脂質體組裸鼠進食情況和活動能力較注射液組優(yōu)，可以初步推斷能夠降低裸鼠全身毒性。
　　結論本研究制備得到的硫酸長春新堿熱敏脂質體具有良好的物理化學性質，工藝穩(wěn)定重現(xiàn)性