db-db小鼠模型中NLRP3炎癥體及凋亡相關通路激活情況.pdf

1、目的：
　　2型糖尿病(T2DM)主要發(fā)病機制是胰島素抵抗?！疤悄虿⊙装Y假說”得到越來越多支持，但對于T2DM中炎癥體激活途徑還存在疑問。近期在細胞水平發(fā)現(xiàn)，不同危險因素導致線粒體受損時，線粒體DNA(mtDNA)發(fā)生氧化，釋放到胞質(zhì)中，激活NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain andleucine-rich repeats containing pyrin domain3

2、)炎癥體，導致炎癥的進一步發(fā)生發(fā)展。本實驗通過T2DM模型檢測NLRP3炎癥體及凋亡相關通路激活情況，以期可以驗證T2DM模型中存在氧化mtDNA激活NLRP3炎癥體這條信號通路，并為發(fā)現(xiàn)T2DM診斷治療方案及新的藥物作用靶點提供可參考的理論依據(jù)。
　　方法：
　　1、使用db/db轉基因小鼠，作為T2DM動物模型，并進行分組糖尿病組(DB/DB組)和正常對照組（CON組）。喂養(yǎng)期間對其體重和血糖（隨機血糖、空腹血糖）進行檢

3、測，觀察其變化，直到小鼠隨機血糖值達到穩(wěn)定狀態(tài)后再進行后期處理。
　　2、使用血糖試紙快速測定法，判斷小鼠是否已達到糖尿病診斷標準(隨機血糖＞11.1mmol/L)。對于達到糖尿病診斷標準的小鼠進行統(tǒng)一處死。
　　3、利用蘇木精-伊紅染色（HE染色）對小鼠的肝臟組織進行染色，觀察小鼠的炎癥及脂肪肝變性情況。
　　4、提取小鼠肝臟組織的原代細胞，使用試劑盒和流式細胞術，檢測小鼠肝臟細胞線粒體膜電位、線粒體活性氧（ROS）

4、含量。用于判別線粒體DNA氧化損傷水平。
　　5、提取小鼠肝臟組織mRNA，利用逆轉錄、熒光定量PCR對NLRP3炎癥體RNA水平表達情況進行檢測。
　　6、提取小鼠肝臟組織總DNA，利用普通PCR和瓊脂糖凝膠電泳檢測完整mtDNA的含量。
　　7、提取小鼠肝臟組織總蛋白，調(diào)整濃度后，使用蛋白印記技術(Western Blot)檢測NLRP3炎癥體(NLRP3、Caspase-1、ASC)以及凋亡相關蛋白(p-P65、

5、P65、P105、PARP、Caspase-3)的蛋白表達水平。使用凱基試劑盒可見光法，檢測氧化應激相關指標，即谷胱甘肽-S轉移酶(GSH-ST)、過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)。
　　8、取小鼠血液，離心取血清。利用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)測定相關炎癥因子(IL-1β、IL-18、TNF-α)血清表達情況。
　　結果：
　　1、db/db小鼠中的DB/DB組達到糖尿病診斷標準

6、。處死前，DB/DB組體重、血糖均明顯高于CON組。
　　2、肝臟組織HE染色確認DB/DB組出現(xiàn)了大量的炎性細胞浸潤、肝細胞脂肪變性明顯，呈空泡狀，有些肝細胞發(fā)生了明顯的核固縮。CON組，肝小葉結構完整，小葉血管中有些充血，其他未見明顯病理改變。
　　3、流式細胞儀檢測顯示，DB/DB組原代肝細胞ROS水平、線粒體膜電位比值均高于CON組。
　　4、熒光定量結果顯示，DB/DB組肝組織的NLRP3炎癥體(NLRP3、

7、Caspase-1、ASC) mRNA水平均高于CON組。
　　5、長片段mtDNA瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，DB/DB組所提取的完整mtDNA的含量低于CON組。
　　6、小鼠肝組織蛋白WB結果顯示，NLRP3炎癥體（Caspase-1、ASC）以及凋亡相關蛋白(p-P65、P65、P105、PARP、Caspase-3)的蛋白表達水平，DB/DB組比CON組表達增高。調(diào)亡相關目的蛋白表達水平檢測，NF-KB和Caspase

8、-3信號通路均被激活。
　　7、可見光法結果顯示，氧化應激指標(GSH-ST、CAT、MDA、SOD)，兩組比較無明顯差異。
　　8、ELISA結果顯示，血清中炎癥因子(IL-1β、IL-18、TNF-α)表達，DB/DB組均高于CON組。
　　結論：
　　1、T2DM動物模型達到糖尿病標準，并在肝臟檢測到炎癥和脂肪肝變性。
　　2、糖尿病進展中，發(fā)生了氧化應激，ROS促使mtDNA發(fā)生氧化，線粒體功能受損