ebv-miR-BART6-5p對(duì)EBV相關(guān)淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究.pdf

1、第一部分EBV miRNA在EBV相關(guān)淋巴瘤中的生物信息學(xué)分析
　　目的：挖掘Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)中潛在的與EBV相關(guān)淋巴瘤有關(guān)的EBV miRNA及其靶基因并進(jìn)行驗(yàn)證。方法：在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)篩選并下載EBV相關(guān)淋巴瘤的miRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE52916和mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE38885，運(yùn)用GEO2R在線分析工具進(jìn)行差異表達(dá)EBV miRNA和mRNA篩選，利

2、用生物信息學(xué)相關(guān)軟件工具進(jìn)行生物學(xué)功能注釋、通路富集、EBV miRNA-mRNA互作分析，對(duì)EBV miRNA在EBV相關(guān)淋巴瘤中的作用進(jìn)行綜合評(píng)估。最后通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)篩選得到的EBV miRNA在EBV陽(yáng)性細(xì)胞Raji、Daudi、Farage和EBV陰性細(xì)胞Ramos、Pfeiffer中進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得了符合納入標(biāo)準(zhǔn)的miRNA和mRNA表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集各一組，篩選得到18個(gè)在EBV陽(yáng)性淋巴瘤中表達(dá)上

3、調(diào)的EBV miRNA和38個(gè)既是生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出的EBV miRNA的靶基因也是在EBV陽(yáng)性淋巴瘤中下調(diào)的mRNA；對(duì)預(yù)測(cè)出的18個(gè)EBV miRNA的靶基因富集獲得了Wnt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等多個(gè)與淋巴瘤發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)的信號(hào)通路；生物學(xué)功能注釋發(fā)現(xiàn)這些EBV miRNA的靶基因參與了淋巴細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程；EBV miRNA-mRNA互作分析顯示篩選得到的18個(gè)EBV miRNA和38個(gè)mRNA中形成68對(duì)調(diào)

4、控關(guān)系，其中ebv-BART11-5p、ebv-BART14-3p、ebv-BART1-3p、ebv-BART6-5p、ebv-BART17-5p、ebv-BART11-3p六個(gè)EBV miRNA調(diào)控了68對(duì)中的37對(duì)，占54％。經(jīng)過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)篩選出的EBV miRNA進(jìn)行表達(dá)差異檢測(cè)，最終ebv-miR-BART1-5p、ebv-miR-BART1-3p、ebv-miR-BART5-5p、ebv-miR-BART6-5p、e

5、bv-miR-BART6-3p、ebv-miR-BART9、ebv-miR-BART14-3p、ebv-miR-BART15、ebv-miR-BART16、ebv-miR-BART17-5p、ebv-miR-BART17-3p這11個(gè)EBV miRNA經(jīng)驗(yàn)證表達(dá)趨勢(shì)與芯片結(jié)果一致。結(jié)論：通過(guò)對(duì)芯片數(shù)據(jù)的挖掘，利用生物信息學(xué)軟件分析，可以獲得在EBV陽(yáng)性淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)的EBV miRNA及其潛在的靶基因，可有效指導(dǎo)下步分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。其

6、中ebv-miR-BART6-5p在EBV陽(yáng)性和陰性細(xì)胞中的表達(dá)差異倍數(shù)較大，并且在EBV miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中處于重要位置，可進(jìn)一步探討其生物學(xué)功能及作用機(jī)制。
　　第二部分 ebv-miR-BART6-5p對(duì)EBV相關(guān)淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究
　　目的：通過(guò)體外分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)探討ebv-miR-BART6-5p對(duì)EBV相關(guān)淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法：電穿孔法轉(zhuǎn)染ebv-miR-BART6-5p沉默和

7、過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建表達(dá)下調(diào)和過(guò)表達(dá)的細(xì)胞模型；利用慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建穩(wěn)定下調(diào)ebv-miR-BART6-5p的EBV陽(yáng)性淋巴瘤細(xì)胞模型，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ebv-miR-BART6-5p的表達(dá)水平；CCK8法測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞Akt、Bax、NF-κB p65、Iκκβ蛋白的表達(dá)量。結(jié)果：通過(guò)電穿孔法構(gòu)建ebv-miR-BART6-5p表達(dá)下調(diào)細(xì)胞模型BART6-5p inh

8、ibitor/Farage和過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型BART6-5p mimics/Pfeiffer，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ebv-miR-BART6-5p的表達(dá)量，BART6-5p inhibitor/Farage組低于miR-shNC/Farage組和Farage組，BART6-5p mimics/Pfeiffer組高于miR-shNC/Pfeiffer組和Pfeiffer組，P＜0.05；CCK8法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果示BART6-5p i

9、nhibitor/Farage組細(xì)胞增殖力低于miR-shNC/Farage組和Farage組，P＜0.05，BART6-5p mimics/Pfeiffer組細(xì)胞增殖力低于Pfeiffer組細(xì)胞，P＜0.05，BART6-5p mimics/Pfeiffer組細(xì)胞增殖力與miR-shNC/Pfeiffer組細(xì)胞的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示BART6-5p inhibitor/Farage組細(xì)胞凋亡率

10、高于Farage組細(xì)胞，P＜0.05，BART6-5p inhibitor/Farage組細(xì)胞凋亡率高于miR-shNC/Farage組細(xì)胞，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，BART6-5p mimics/Pfeiffer組細(xì)胞凋亡率高于Pfeiffer組細(xì)胞，P＜0.05，BART6-5p mimics/Pfeiffer組細(xì)胞凋亡低于miR-shNC/Pfeiffer組細(xì)胞，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。利用慢病毒載體成功構(gòu)建了e

11、bv-miR-BART6-5p穩(wěn)定下調(diào)的GV-BART6-5p down/Farage細(xì)胞模型，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)ebv-miR-BART6-5p的表達(dá)量明顯低于于未轉(zhuǎn)染的Farage細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照病毒的NC/Farage細(xì)胞，P＜0.05；CCK8測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線結(jié)果顯示GV-BART6-5p down/Farage組細(xì)胞增殖能力明顯低于Farage和NC/Farage組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三組

12、細(xì)胞的凋亡率發(fā)現(xiàn)GV-BART6-5p down/Farage組細(xì)胞的凋亡率高于Farage和NC/Farage組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05；Western Blot檢測(cè)GV-BART6-5p down/Farage組細(xì)胞中Akt、NF-κB p65、Iκκβ蛋白的表達(dá)量較Farage和NC/Farage組細(xì)胞下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，Bax蛋白表達(dá)量較Farage組細(xì)胞上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，

13、較NC/Farage組細(xì)胞表達(dá)量上調(diào)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。結(jié)論：ebv-miR-BART6-5p有促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡的可能，可以上調(diào)細(xì)胞PI3K/Akt、NF-κB信號(hào)通路的活性，抑制凋亡誘導(dǎo)蛋白Bax的表達(dá)。
　　第三部分 ebv-miR-BART6-5p的靶基因驗(yàn)證
　　目的：前期體外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)改變EBV陽(yáng)性淋巴瘤細(xì)胞Farage的ebv-miR-BART6-5p表達(dá)可以影響淋巴瘤細(xì)胞的增

14、殖和凋亡，本部分對(duì)ebv-miR-BART6-5p的靶基因及其結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。方法：利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)靶基因，WesternBlot技術(shù)檢測(cè)GV-BART6-5p down/Farage、NC/Farage和Farage三組細(xì)胞中靶蛋白表達(dá)量，最后通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)驗(yàn)證靶基因的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)同時(shí)結(jié)合EBV miRNA-mRNA互作圖，選擇DICER1作為候選靶基因進(jìn)行驗(yàn)證。Western Blo