Dynamin蛋白在內毛細胞突觸囊泡內吞作用及其與聽力的關系.pdf

1、研究背景:
　　目前聽力障礙被認為是發(fā)達國家最普遍的殘疾，而感音神經性耳聾患者占了其中大部分的比例，所以研究感音神經性耳聾的發(fā)病機制對疾病的防治至關重要。聽覺信號從外周傳入聽覺中樞需要耳蝸內毛細胞突觸釋放興奮性神經遞質，引起突觸后膜產生動作電位，實現聽信號由機械信號-化學信號-電信號的轉化，再逐級傳入中樞形成聽力。內毛細胞突觸間神經遞質持續(xù)、有效的釋放需要一個高效的囊泡回收機制?？茖W研究證明，網格蛋白介導的內吞作用(CME)是囊泡

2、回收的主要途徑，對視網膜細胞、神經元細胞的研究發(fā)現，Dynamin在內吞過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。Dynamin的具體作用是其在網格蛋白包裹的內陷囊泡頸部聚集形成螺旋狀結構，通過水解GTP調節(jié)自身收縮，將囊泡與質膜分離開。研究表明，Dynamin缺失會引起CME功能缺陷，突觸囊泡數量減少，導致釋放神經遞質的能力大大減弱。Dynamin敲除小鼠會出現視力障礙，而對于Dynamin在內耳毛細胞中的分布情況、作用機制及其對聽力的影響，目前研

3、究較少。
　　本課題從Dynamin各亞型在內毛細胞的表達定位情況入手，分析Dynamin各亞型在不同年齡小鼠內毛細胞表達模式的差異及其與聽力變化的相關性。利用目前檢測突觸囊泡功能的電生理膜片鉗實驗，檢測Dynamin在內毛細胞中是如何調控突觸囊泡內吞作用的，通過以上實驗技術，從體內、體外實驗，從形態(tài)學、分子生物學及生理學等方面了解Dynamin，明確其在內毛細胞網格蛋白介導的內吞過程中的可能作用。
　　實驗方法:
　

4、　1、取正常成年昆明小鼠耳蝸基底膜行免疫熒光染色，對Dynamin各亞型在小鼠耳蝸內毛細胞進行初步表達定位，明確Dynamin各亞型在耳蝸內毛細胞中有表達;
　　2、明確蛋白有表達后，分別取出生后2周、10周、16月齡的昆明小鼠，依次分為幼年組、成年組、老年組，測定各組聽性腦干反應(ABR)閾值，評估小鼠聽力變化;
　　3、采用免疫熒光法觀察各年齡階段小鼠耳蝸內毛細胞Dynamin亞型的表達情況、及細胞形態(tài)學變化，探討蛋白表

5、達情況與年齡及聽力的相關性;
　　4、采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測不同年齡段Dynamin各亞型mRNA表達情況，檢測不同年齡對Dynamin表達的影響，進而探討其與聽力的相關性;
　　5、采用全細胞膜片鉗技術初步探查阻斷Dynamin后內毛細胞膜電容變化情況，了解其在突觸囊泡內吞過程中的作用。
　　實驗結果:
　　1、正常成年小鼠Dynamin各亞型在耳蝸內毛細胞中均有表達。其中，Dynamin

6、-1表達于整個內毛細胞，Dynamin-2分布在內毛細胞核周圍及部分胞質，Dynamin-3散在高表達于內毛細胞核下方靠近螺旋神經節(jié)區(qū)域。
　　2、各年齡組所測得ABR閾值分析得出，小鼠隨年齡增大閾值逐漸增高，成年組與幼年組ABR平均閾值差異無統計學意義，老年組存在明顯的聽力下降，分別與成年組、幼年組相比聽力存在明顯差異(P＜0.05)。
　　3、比較不同年齡組Dynamin不同亞型熒光染色圖像后發(fā)現，幼年組與成年組Dyna

7、min-1、Dynamin-2分布于內細胞質，老年組Dynamin-1在細胞核下部分域存在缺失，Dynamin-2則僅僅表達于內毛細胞核周圍。三個年齡組Dynamin-3的定位無差別，均散在定位于內毛細胞核下基底部，靠近螺旋神經節(jié)區(qū)域，老年組染色較幼年、成年更稀疏、表達更少。
　　4、小同年齡組各亞型mRNA表達水平顯示，與幼年組相比，Dynamin-1表達量隨年齡增加逐漸減少(P＜0.05)，Dynamin-2在成年表達量至高峰

8、，之后逐漸減少。Dynamin-3的表達情況未能檢測出。
　　5、在用Dyngo-4a抑制Dynamin的作用后，采用全細胞膜片鉗技術記錄耳蝸內毛細胞△Cm增大，由于數據較少，暫不能完成統計學分析。
　　結論:
　　Dynamin各亞型在小鼠內毛細胞均有表達定位，Dynamin-1、Dynamin-2隨著年齡的增加表達量有所改變。內耳毛細胞存在網格蛋白介導的內吞作用(CME)，并且Dynamin在其中扮演重要角色。Dy

9、namin的不同亞型在不同年齡階段對CME交替發(fā)揮著作用，即Dynamin-1主要在幼年時期發(fā)揮主要作用，到成年階段Dynamin-2可能取代了Dynamin-1的作用影響著CME過程。由此推測Dynamin-2可能參與整個聽力的發(fā)展過程，尤其在成年時期，而Dynamin-1對幼年時期的聽力起到了一定作用，我們認為Dynamin-3在內毛細胞CME或聽力形成中起到的作用尚不明確。全細胞膜片鉗技術記錄Dynamin的作用被抑制后，囊泡內吞