P53缺失型HL-60白血病細胞內Nucleostemin下調對mTOR通路介導的自噬活性的影響.pdf

1、目的：
　　結合本課題組前期關于 p53缺失型 HL-60白血病細胞內 PI3K/AKT/mTOR通路的研究結果，進一步探討下調Nucleostemin（NS）對p53缺失型HL-60白血病細胞內mTOR通路介導的自噬活性的影響，為研究PI3K/AKT/mTOR通路作為NS非p53依賴性信號通路的關鍵節(jié)點提供依據(jù)。
　　方法：
　?。?）制備重組質粒（編碼慢病毒顆粒）和兩種輔助包裝原件的載體質粒，共轉染293T細胞，收

2、集富含病毒顆粒的上清液，濃縮后用293T細胞測定其病毒滴度。
　?。?）分別以低MOI值（MOI=40）和高MOI值（MOI=80）的慢病毒轉染液感染HL-60細胞確定慢病毒感染HL-60細胞的合適MOI值。
　?。?）根據(jù)合適的MOI值，將NS-RNAi-GV248慢病毒載體轉染至HL-60細胞，通過熒光倒置顯微鏡和Western blot確定轉染的效率和NS蛋白的下調情況。
　?。?）采用吖啶橙染色觀察慢病毒載體轉

3、染后空白對照組、陰性對照組和實驗組HL-60細胞內亮紅色酸性小體（acid vesicular organelle，AVO）數(shù)量的變化。
　?。?）以自噬誘導劑雷帕霉素刺激HL-60細胞所提取的蛋白作為自噬陽性對照蛋白，檢測慢病毒轉染后空白對照組、陰性對照組和實驗組內自噬特異性蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的變化。
　?。?）采用透射電鏡檢測慢病毒轉染后空白對照組、陰性對照組和實驗組中HL-60細胞內自噬性結構數(shù)量的變化。

4、>　?。?）采用Image J圖像處理軟件對蛋白條帶的灰度進行分析和計算。運用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（ x±s）表示。多組樣本間的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩的比較采用Bonferroni法，校正檢驗水準α，=0.0167。
　　結果：
　?。?）成功包裝NS-RNAi-GV248慢病毒載體，其滴度為4×108TU/ml。
　?。?）NS-RNAi-GV248慢病毒載體感染

5、HL-60細胞的最適MOI值為80。在MOI=80的感染條件下，熒光倒置顯微鏡檢測顯示慢病毒載體轉染效率大于80％，實驗組中HL-60細胞NS蛋白出現(xiàn)了明顯的下調。
　　（3）吖啶橙染色結果顯示，實驗組HL-60細胞內AVO數(shù)量[（22.4±0.76）%]高于空白對照組[（3.1±0.28）%]和陰性對照組[（6.2±0.64）]%（p＜0.05）；Western blot結果顯示實驗組中HL-60細胞LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值（1

6、.537±0.072）高于陰性對照組（1.010±0.039）和空白對照組（0.608±0.008）（p＜0.05）；透射電鏡檢測顯示實驗組中 HL-60細胞內自噬性結構的數(shù)量（8.7±3.1）高于陰性對照組（4.2±1.2）和空白對照組（2.3±0.5）（p＜0.05）。
　　結論：
　?。?）下調NS蛋白的表達可以增強HL-60細胞的自噬活性。
　?。?）NS變化引起的自噬活性的改變，提示mTOR通路可能屬于NS的