Cx43對休克大鼠血管滲漏和血管低反應性的調節(jié)作用及機制.pdf

1、休克為創(chuàng)傷最常見的并發(fā)癥，其發(fā)生率和死亡率都很高。嚴重創(chuàng)傷/休克病人廣泛存在血管功能下降，主要包括兩個方面:一是休克后血管反應性下降，即是全身血管對內源性和外源性血管舒縮物質反應性降低或是不反應。這種血管的低反應性嚴重影響休克的發(fā)生發(fā)展及治療，是導致休克晚期血壓難以回升和致死的主要原因之一。二是休克后血管屏障功能下降，即血管滲漏，也叫血管通透性升高，特別是創(chuàng)傷失血休克繼發(fā)的嚴重膿毒癥、膿毒性休克。血管滲漏可使血管內液體外滲，導致組織水腫

2、和有效循環(huán)量的進一步下降，影響組織和器官功能，并最終發(fā)展為多器官功能障礙(MODS)，其死亡率高達40-70％。
　　目前研究證實血管低反應性的發(fā)生機制主要有:血管平滑肌細胞膜受體失敏機制、膜超極化及我們實驗室提出的鈣失敏學說。血管滲漏的機制主要包括兩種途徑:跨內皮細胞途徑和內皮細胞旁途徑。這兩種途徑在休克血管滲漏中發(fā)揮著主要作用，血管內皮生長因子(VEGF)，凝血酶（thrombin），TNF-α等多種細胞因子主要也是通過這兩條

3、通路來影響血管的屏障功能。
　　縫隙連接是一種細胞間的重要結構，在血管中呈現(xiàn)高表達，可介導細胞間多種電化學信號的傳導，參與多種血管功能的調控。Cx43是細胞間縫隙連接的主要構成蛋白，研究發(fā)現(xiàn)Cx43在多種血管疾病中發(fā)揮重要的作用，如:動脈粥樣硬化，高血壓等。我們前期研究發(fā)現(xiàn)Cx43參與休克后血管反應性的調控，但其機制不清。最近有研究顯示在酸吸入所導致的急性肺損傷中，Cx43的表達在肺血管的通透性變化中發(fā)揮重要作用，那么縫隙連接蛋白

4、Cx43是否會參與在休克后血管滲漏的調節(jié)，機制如何？目前尚不清楚。
　　研究已證實Rho激酶信號通路和PKC信號通路在調節(jié)細胞骨架、引起細胞收縮和細胞遷移等方面發(fā)揮關鍵的作用。我們前期的研究證實Rho激酶通路和PKC信號通路在休克后血管低反應性的調節(jié)中發(fā)揮重要的作用。另外也有研究發(fā)現(xiàn)在血管滲漏方面，Rho激酶通路也起著關鍵的作用，如RhoA/Rock通路介導了凝血酶引起的血管內皮通透性的增加。研究證實骨橋蛋白可作為一種信號分子參與

5、與血管相關的多種病理生理變化的調節(jié):如細胞粘附，血管生成和細胞遷移。例如OPN通過改變內皮屏障功能介導了由VEGF誘導的細胞遷移。此外， OPN可激活FAK和ERK信號通路，而這些信號通路可導致細胞的剛度變化和細胞骨架重排。這些生理和病理事件都提示OPN可能與血管內皮屏障功能有密切的關系，但具體的機制不清楚。那么Rho激酶通路和OPN是否參與休克后Cx43對血管滲漏和血管反應性的調節(jié)呢，尚不清楚。
　　目的：
　　首先利用嚴

6、重膿毒癥大鼠模型和體外LPS刺激肺靜脈血管內皮細胞，研究了Cx43在嚴重膿毒癥血管滲漏中的作用及其與Rho激酶，PKC和OPN的關系;第二，利用大鼠出血性休克模型，以及缺血缺氧處理的血管環(huán)和血管平滑肌細胞研究了Cx43在休克血管反應性調節(jié)中的作用及其與Rho激酶和PKC的關系。
　　方法:
　　第一部分 Cx43在調節(jié)嚴重膿毒癥大鼠血管滲漏中的作用及機制。
　　1.初步探討Cx43在嚴重膿毒癥血管滲漏中的作用:利用嚴重

7、膿毒癥大鼠及LPS刺激的肺靜脈血管內皮細胞(VEC)，觀察血管滲漏情況和血管Cx43蛋白表達變化;利用慢病毒轉染肺靜脈血管內皮細胞，改變Cx43的表達，測定了單層VECs的TER和對熒光白蛋白(FITC-BSA)透過率的變化。
　　2.Rho激酶在Cx43調節(jié)血管滲漏中的作用及機制研究:利用Cx43高表達和正常的肺靜脈血管內皮細胞，觀察Rho激酶抑制劑對Cx43調節(jié)休克血管滲漏的影響及Cx43對Rho激酶表達的影響。
　　3

8、.OPN/緊密連接蛋白在Cx43調節(jié)休克血管滲漏中的作用及機制研究:利用嚴重膿毒癥大鼠和LPS刺激的肺靜脈血管內皮細胞，測定OPN，zo-1，claudin-5表達變化及血管滲漏的變化，及OPN的RNA干擾對血管滲漏及zo-1和claudin-5表達的影響;及利用Cx43轉染的肺靜脈血管內皮細胞，觀察Cx43對OPN表達的影響及Cx43對OPN上游轉錄因子表達的影響。
　　第二部分 Cx43在調節(jié)失血性休克大鼠血管低反應性中的作用

9、及機制。
　　1.Cx43在PDGF調節(jié)血管反應性中的作用及與PKC和Rho激酶的關系:利用失血性休克大鼠及缺氧血管環(huán)，觀察MEGJ阻斷劑和Cx43AODN對休克血管鈣敏感性和反應性的影響;利用血管平滑肌細胞，觀察了Rho激酶和PKC的抑制劑在PDGF調節(jié)血管反應性中的作用，及Cx43AODN在PDGF調節(jié)Rho激酶和PKC活性中的作用。
　　2.Cx43在BK調節(jié)血管反應性中的作用及機制:利用失血性休克大鼠缺氧處理的血管環(huán)

10、，觀察MEGJ阻斷劑18α-GA對血管反應性的影響，及Rho激酶和PKC抑制劑在Cx43介導BK調節(jié)休克血管反應性中的作用及機制。
　　結果：
　　第一部分 Cx43對嚴重膿毒癥血管滲漏的調節(jié)作用及機制
　?。ㄒ唬〤x43在嚴重膿毒癥血管滲漏中的作用
　　Cx43參與了嚴重膿毒癥血管血管滲漏的發(fā)生，Cx43表達變化與通透性變化呈正相關，改變Cx43的表達可顯著調節(jié)血管滲漏。提示Cx43在嚴重膿毒癥血管滲漏中發(fā)揮重

11、要的作用。
　　（二）Rho激酶-MLC20在Cx43調節(jié)血管滲漏中的作用及機制研究
　　LPS刺激和Cx43高表達可顯著升高白蛋白的透過率和降低TER值，改變內皮細胞應激纖維的形態(tài)，使細胞呈現(xiàn)向中心收縮。Rho激酶抑制劑Y-27632可減輕透過率的升高和TER值的降低及抑制細胞向心收縮。LPS刺激和Cx43高表達可顯著性升高Rho激酶的表達，Cx43RNAi可降低了Rho激酶的表達。LPS刺激和Cx43高表達可顯著升高的M

12、LC20的磷酸化水平，Rho激酶抑制劑可抑制MLC20磷酸化升高。Cx43的高表達可上調Rho激酶蛋白表達水平。提示Rho激酶-MLC20通路參與了Cx43對休克血管滲漏的調節(jié)
　　（三）OPN/緊密連接蛋白在Cx43調節(jié)血管滲漏中的作用及機制研究
　　嚴重膿毒癥大鼠和LPS刺激內皮細胞后，OPN的表達顯著升高，zo-1和claudin-5的表達逐漸降低。Cx43高表達顯著性地降低了zo-1和claudin-5的表達。Cx4

13、3干擾對zo-1和claudin-5的表達沒影響，但能阻止LPS刺激引起的zo-1和claudin-5表達的下降。OPN干擾可抑制Cx43對zo-1和claudin-5表達的下調。提示，OPN介導了Cx43對休克血管滲漏的調節(jié)。Cx43高表達顯著性地升高了Tcf-4和β-catenin的mRNA水平及上調了OPN的表達，β-catenin和Tcf-4的RNA干擾可抑制Cx43對OPN表達的上調。證實了Cx43對OPN的調節(jié)是通過轉錄因子

14、Tcf-4/β-catenin來實現(xiàn)的。
　　第二部分 Cx43調節(jié)失血性休克大鼠血管反應性及其機制
　　（一）Cx43介導PDGF調節(jié)血管反應性及與PKC和Rho激酶的關系
　　PDGF可明顯改善休克后血管的反應性，MEGJ的阻斷劑18-GA和Cx43AODN抑制了PDGF對休克血管反應性的改善作用。PKC抑制劑和Rho激酶抑制劑可顯著抑制PDGF對休克血管反應性和鈣敏感性的的改善作用。PDGF可明顯升高缺氧血管中R

15、ho激酶底物MYPT和PKC底物PeptagC1的磷酸化，Cx43AODN明顯抑制了PDGF對缺氧血管MYPT和PeptagC1的磷酸化改善作用。提示Cx43通過激活PKC和Rho激酶通路，介導了PDGF對休克血管反應性的調節(jié)。
　　（二）Cx43在BK調節(jié)血管反應性中的作用及機制
　　BK顯著改善休克后血管的反應性，MEGJ阻斷劑18-GA和Cx43AODN顯著性的降低了血管對BK的反應性。BK可磷酸化Cx43的ser36

16、8位點及激活Rho激酶，PKC-α和PKC-ε的活性，BK對休克血管的改善作用可被Rho激酶抑制劑和PKC抑制劑所阻斷。PKC和Rho激酶的激動劑可改善休克血管對BK的反應性，這種作用可被Cx43AODN所阻斷。提示，Cx43通過其ser368位點磷酸化和PKC，Rho激酶通路，參與了BK對休克血管反應性的調節(jié)。
　　結論：
　　1.Cx43參與了休克后血管通透性的調節(jié)，一方面Cx43通過激活Rock1-MLC20通路，使細