TRPC3參與糖氧剝奪致培養(yǎng)的少突膠質細胞凋亡.pdf

1、背景：
　　隨著社會人口老齡化，神經退行性疾病的發(fā)病率日益增高，而臨床上，對于這類疾病尚無有效控制病程進展的措施。瑞士研究者發(fā)現神經系統(tǒng)退行性疾病與髓鞘脫失有關，進一步研究證明少突膠質細胞退化導致脫髓鞘，少突膠質細胞對缺血缺氧損傷較其他膠質細胞敏感，在大腦的某些特定區(qū)域甚至比神經元對缺血缺氧損傷更敏感。因此，有學者提出少突膠質細胞的缺血缺氧損傷是神經退行性疾病重要原因。
　　鈣離子是調節(jié)各個流程的通用第二信使，是細胞間信號傳

2、遞的關鍵離子，鈣穩(wěn)態(tài)紊亂是缺氧缺血后神經細胞死亡諸多途徑的共同節(jié)點。介導外鈣內流主要有：電壓依賴的和非電壓依賴的鈣通道兩種方式，瞬時受體電位通道蛋白(transient receptor potential channel，TRPC)是一類非電壓依賴跨膜蛋白，是維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的重要離子通道。TRPC在中樞神經系統(tǒng)表達廣泛，參與了神經系統(tǒng)很多重要的生理功能，其中TRPC3在中樞神經系統(tǒng)中表達最廣泛。研究表明TRPC3異常激活可致神經退行

3、性疾病，但是TRPC3是否參與缺血缺氧少突膠質細胞的損傷，目前并不清楚。
　　我們?yōu)檠芯縏RPC3是否參與缺血缺氧少突膠質細胞的損傷，本實驗體外培養(yǎng)少突膠質細胞，建立少突膠質細胞糖氧剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）模型，采用了TRPC3阻斷劑Pyr3阻斷OGD少突膠質細胞后，檢測少突膠質細胞存活和凋亡的變化及細胞內鈣離子濃度的改變。旨在探討 TRPC3是否參與了糖氧剝奪少突膠質細胞凋亡，為神經退

4、行性疾病的防治提供新的理論依據和可行的途徑。
　　方法:
　　第一部分
　　1.取SD乳鼠腦皮質，采用兩種不同的細胞增殖法和兩種不同的分離純化法分四組培養(yǎng)，A組為細胞因子增殖聯合搖床震蕩分離純化法，B組為B104CM（the conditioned medium prepared from B104 neuroblastoma cells，B104CM）增殖聯合搖床震蕩分離純化法，C組為細胞因子增殖聯合EDTA消化機械

5、吹打分離純化法，D組為B104CM增殖聯合EDTA消化機械吹打分離純化法。倒置顯微鏡下觀察神經細胞形態(tài)學變化并對各組細胞進行計數。
　　2.用A2B5和髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）檢測其少突膠質細胞生物學特性并分析其純度。
　　3.建立體外少突膠質細胞OGD損傷模型的方法:三氣培養(yǎng)箱缺氧、無糖DMEM相結合的方法，即培養(yǎng)箱調整為（94％N2+5%CO2+1%O2)，培養(yǎng)基更換為無糖DMEM

6、，分別培養(yǎng)1h，2h，3h后取出細胞，更換為正常少突膠質細胞培養(yǎng)基，恢復正常的培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)，同時常氧常糖設置為正常對照。
　　4.細胞活力及凋亡改變的檢測：OGD1h，2h，3h后，恢復正常條件復氧培養(yǎng)24h，MTT比色法測定細胞活力變化；Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術檢測細胞的凋亡率。比較1h，2h，3h對細胞的損傷程度，確定適合少突膠質細胞合適的OGD時間。
　　第二部分
　　1.建立體外少突

7、膠質細胞OGD損傷模型：采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧與DMEM缺糖相結合構建少突膠質細胞OGD損傷模型。
　　2.采用蛋白質免疫印跡法檢測OGD損傷模型少突膠質細胞TRPC3蛋白的表達變化。
　　3.實驗分組：以原代培養(yǎng)的新生SD大鼠少突膠質細胞為對照組，以OGD少突膠質細胞為模型組，將模型組+Pyr3阻斷組設為處理組。
　　4.MTT檢測各組細胞活力，AnnexinV-FITC試劑盒染色后經流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。

8、r>　　5.fluo-3染色后經流式細胞儀和激光共聚焦顯微鏡測定各組細胞內游離鈣的變化。
　　結果:
　　1.B104CM增殖聯合EDTA消化機械吹打分離純化法較其他三種培養(yǎng)方法收獲的OPC數量多。
　　2.少突膠質細胞A2B5和MBP特異性標記，細胞純度可達到95%。
　　3.MTT結果顯示，OGD1h少突膠質細胞細胞活力即降低，隨著缺氧時間延長細胞活力呈降低的趨勢。流式細胞測細胞凋亡的結果表明
　　OG

9、D1h、2h、3h，細胞早期凋亡率分別為（14.43±0.20）%、（21.99±0.42）%、(44.71±0.20）%，與正常對照組（6.86±0.05）％相比，均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　4.OGD損傷模型少突膠質細胞TRPC3蛋白表達增加。
　　5.OGD組細胞活性為（54.34±6.55）%，凋亡率為（24.24±0.86）%，與對照組有顯著差異(P＜0.05)，Pyr3處理組細胞存活率為（72.26±5

10、.41）%，凋亡率為（14.82±0.28）%，與OGD組有顯著差異(P＜0.05)。
　　6.激光共聚焦測鈣離子濃度結果顯示，正常對照組熒光強度為（28.89±4.43）%，OGD組熒光強度為（58.05±5.80）%、處理組熒光強度為（42.26±5.44）%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。流式細胞技術測定細胞內鈣離子濃度結果顯示，正常對照組熒光強度為（4.15±0.65）%，OGD組熒光強度為（23.99±1.22）%，

11、處理組熒光強度為（10.54±0.73）%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組結果均顯示，OGD組細胞內鈣水平升高，而加入TRPC3阻斷劑Pyr3后，胞內鈣增加得到顯著抑制。
　　結論:
　　1.B104CM增殖聯合EDTA消化機械吹打分離純化培養(yǎng)法簡單可行，具有穩(wěn)定的可重復性，可用于少突膠質細胞的培養(yǎng)。
　　2.采用三氣培養(yǎng)箱物理缺氧與DMEM缺糖相結合可有效的構建少突膠質細胞OGD損傷模型。OGD2h可能是少突