膜粘連蛋白Ⅱ在顱腦創(chuàng)傷后急性期與慢性期中的神經(jīng)保護作用及機制研究.pdf

1、第一部分膜粘連蛋白Ⅱ通過保護血腦屏障對小鼠顱腦創(chuàng)傷后早期神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
　　目的：
　　評估外源性重組 A2對創(chuàng)傷性顱腦損傷后早期神經(jīng)功能預(yù)后以及血腦屏障的影響，探討A2作為腦創(chuàng)傷治療靶點的可能性。
　　方法：
　　實驗一：內(nèi)源性 A2蛋白在 CCI后不同時間點和不同細胞內(nèi)表達的變化
　　在成年雄性小鼠上建立精確皮質(zhì)打擊模型，檢測傷前與傷后不同時間點（6小時，1天，3天，5天，7天，14天，21天）傷側(cè)

2、半球腦組織A2蛋白的表達；用CD31、GFAP、NeuN分別標記內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，再與A2抗體行雙重染色檢測傷后A2在不同細胞類型中表達的變化情況。
　　實驗二：外源性A2蛋白對CCI后BBB通透性、腦水腫以及海馬神經(jīng)元存活的影響
　　體外培養(yǎng)內(nèi)皮細胞并建立損傷模型，檢測 rA2對傷后內(nèi)皮細胞電阻、內(nèi)皮細胞屏障通透性和內(nèi)皮細胞活力的影響；小鼠 CCI傷后通過靜脈注射伊文思藍染料并測定半球染料含量，檢測rA2對B

3、BB通透性的影響；通過干濕重法測定傷后大腦半球組織含水量，檢測 rA2對傷后腦水腫的影響；免疫組織熒光對 CCI后海馬區(qū)神經(jīng)元進行標記并定量，檢測 rA2傷后海馬神經(jīng)元存活的影響；給予離體缺氧處理的神經(jīng)元中加入內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基，檢測 rA2通過內(nèi)皮細胞對受損神經(jīng)元的細胞活力影響。
　　實驗三：外源性 A2蛋白對 CCI后早期神經(jīng)功能恢復(fù)和傷灶體積的影響
　　通過NSS評分、Wire-gripping實驗分別對CCI傷后小鼠

4、進行檢測，觀察rA2對顱腦創(chuàng)傷后早期神經(jīng)功能恢復(fù)的影響；對CCI傷后小鼠的組織切片進行HE染色，觀察rA2對顱腦創(chuàng)傷后傷灶體積的影響。
　　實驗四：外源性A2蛋白對腦損傷后BBB保護作用的機制
　　通過明膠酶譜法，檢測rA2對顱腦創(chuàng)傷后腦組織MMP-9活性的影響；通過對傷側(cè)腦組織中蛋白質(zhì)定量，檢測rA2對顱腦創(chuàng)傷后VEGF、Occludin、Claudin-5和ZO-1表達的影響；建立體外內(nèi)皮細胞損傷模型，檢測rA2對內(nèi)皮細

5、胞應(yīng)力纖維形成的影響。
　　結(jié)果：
　　實驗一：從傷后3天起，A2表達明顯增高（P<0.05），并在7天時達到高峰（P<0.05）。此后，蛋白表達逐漸下降，21天時恢復(fù)到基值。對比傷前與傷后免疫組織熒光結(jié)果，傷前內(nèi)皮細胞幾乎不表達A2，傷后在傷側(cè)部分內(nèi)皮細胞表達 A2；傷前星形膠質(zhì)細胞部分表達 A2，傷后雙側(cè)膠質(zhì)細胞均有活化，且活化的膠質(zhì)細胞都能表達A2；神經(jīng)元細胞在傷前已有A2表達，傷后未見明顯改變。
　　實驗二：在

6、內(nèi)皮細胞損傷后rA2能顯著提高內(nèi)皮細胞電阻（P<0.05）和細胞活力（P<0.05），并降低FITC-dextran通過內(nèi)皮細胞屏障的數(shù)量（P<0.05）；通過在傷后不同時間點（2小時，4小時，6小時）將不同劑量rA2（0.75mg/kg，1mg/kg，1.5mg/kg）通過尾靜脈注入小鼠體內(nèi)，均能顯著降低傷后腦組織EB滲出量（P<0.05）；給予rA2不能顯著改變傷后腦組織水腫狀況（P>0.05）；rA2能顯著減少傷后7天 CA1和C

7、A3區(qū)神經(jīng)元丟失，減輕海馬區(qū)結(jié)構(gòu)破壞（P<0.05）；給予rA2的內(nèi)皮細胞條件培養(yǎng)基能顯著提高缺氧損傷神經(jīng)元的活力（P<0.05）。
　　實驗三：NSS評分結(jié)果證實rA2能顯著提高傷后7天內(nèi)運動相關(guān)行為學(xué)表現(xiàn)（P<0.05），Wire-gripping實驗中rA2組小鼠的表現(xiàn)與對照組無顯著差別（P>0.05）；HE染色證實給予 rA2后傷灶體積無明顯改變（P>0.05）。
　　實驗四：rA2對傷后7天小鼠腦組織 MMP-9活

8、性無顯著影響（P>0.05）；rA2對傷后7天小鼠腦組織中VEGF、Occludin和Claudin-5表達無顯著影響（P>0.05）；rA2能顯著增加傷后7天小鼠腦組織中ZO-1表達（P<0.05）；給予rA2后受損的內(nèi)皮細胞內(nèi)的應(yīng)力纖維數(shù)量顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在創(chuàng)傷性顱腦損傷早期，rA2能提高內(nèi)皮細胞ZO-1合成，減少細胞內(nèi)應(yīng)力纖維數(shù)量，從而穩(wěn)定內(nèi)皮細胞間緊密連接，減少BBB通透性。這種BBB的修

9、復(fù)作用能保護神經(jīng)組織，從而減少神經(jīng)元凋亡，促進傷后早期神經(jīng)功能恢復(fù)。
　　第二部分膜粘連蛋白Ⅱ通過血管再生途徑對小鼠顱腦創(chuàng)傷后遠期神經(jīng)功能恢復(fù)的影響
　　目的：
　　評估外源性重組 A2對創(chuàng)傷性顱腦損傷后長期神經(jīng)功能預(yù)后的影響，同時探討A2促進神經(jīng)功能修復(fù)的機制。
　　方法：
　　實驗一：外源性A2蛋白對顱腦創(chuàng)傷后遠期神經(jīng)功能恢復(fù)和傷灶體積的影響
　　通過NSS評分、轉(zhuǎn)棒實驗和水迷宮實驗分別將CCI傷

10、后小鼠進行檢測，觀察rA2對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)功能恢復(fù)的影響；對CCI傷后小鼠的組織切片進行HE染色，觀察rA2對顱腦創(chuàng)傷后傷灶體積的影響。
　　實驗二：外源性A2蛋白對顱腦創(chuàng)傷后血管再生的影響及其機制
　　離體培養(yǎng)內(nèi)皮細胞，檢測 rA2對內(nèi)皮細胞增殖、管腔結(jié)構(gòu)形成和運動遷移的影響；通過CD31/Brdu標記新生內(nèi)皮細胞，檢測rA2對顱腦創(chuàng)傷后內(nèi)皮細胞增殖的影響；通過靜脈注射Lectin，檢測rA2對顱腦創(chuàng)傷后功能性血管密度的影

11、響；分離傷后皮質(zhì)微血管并進行原位酶活性檢測，比較rA2對顱腦創(chuàng)傷后血管血纖維蛋白溶酶活性的影響。
　　實驗三：外源性A2蛋白對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)再生的影響及其機制
　　通過標記Nestin/Brdu標記增殖的神經(jīng)干細胞，檢測rA2對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)干細胞增殖的影響；通過 NeuN/Brdu標記新生的神經(jīng)元，檢測rA2對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)再生的影響；通過PSA-NCAM/Brdu標記新生的成神經(jīng)細胞，檢測 rA2對顱腦創(chuàng)傷后成神經(jīng)細胞遷

12、移的影響；通過對傷側(cè)腦組織中蛋白質(zhì)定量，檢測 rA2對顱腦創(chuàng)傷后神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響；分離傷后皮質(zhì)微血管并提取mRNA，檢測rA2對顱腦創(chuàng)傷后血管內(nèi)皮內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。
　　結(jié)果：
　　實驗一：NSS評分、轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果證實rA2能顯著提高傷后28天內(nèi)運動相關(guān)行為學(xué)表現(xiàn)（P<0.05），水迷宮實驗中rA2組小鼠的空間記憶能力明顯優(yōu)于對照組小鼠（P<0.05）；HE染色證實給予 rA2后傷灶體積無明顯改變（P>0.

13、05）。
　　實驗二：離體培養(yǎng)條件下，rA2能顯著促進內(nèi)皮細胞增殖、管腔結(jié)構(gòu)形成與運動遷移能力（P<0.05）；rA2能顯著增加CCI傷后7天內(nèi)海馬和傷灶周圍內(nèi)皮細胞增殖（P<0.05）；傷后28天時，rA2組傷灶周圍皮質(zhì)功能性血管密度顯著高于對照組（P<0.05），但海馬區(qū)血管網(wǎng)密度無明顯變化（P>0.05）；rA2提高傷后7天皮質(zhì)微血管內(nèi)血纖維蛋白溶酶活性。
　　實驗三：rA2對傷后早期SGZ和SVZ區(qū)域的神經(jīng)干細胞分裂

14、增殖無顯著作用（P>0.05），但是卻能增加后期傷灶區(qū)域新生神經(jīng)元的數(shù)量（P<0.05）; rA2增加了傷后7天內(nèi)遷移至傷灶周圍以及海馬齒狀回的新生神經(jīng)元數(shù)量（P<0.05）；rA2增加傷側(cè)腦組織中 BDNF、VEGF的含量；分離傷后7天時小鼠腦組織皮質(zhì)微血管，rA2組微血管內(nèi)BDNF、VEGF的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著對照組（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　在創(chuàng)傷性顱腦損傷后，rA2能提高微血管內(nèi)血纖維蛋白溶酶活性，從而促進