轉(zhuǎn)基因植物外源基因的精確調(diào)控與安全轉(zhuǎn)化平臺研究.pdf

1、隨著分子生物學(xué)和生物技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也取得了長足的進(jìn)步，如何高效的獲得無選擇標(biāo)記、穩(wěn)定可育、高安全性的轉(zhuǎn)基因植株成為植物遺傳轉(zhuǎn)化發(fā)展的方向?；蚬こ虇柺赖?0年來，植物遺傳轉(zhuǎn)化的技術(shù)也得到了飛速發(fā)展，遺傳轉(zhuǎn)化方法包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法(又稱微彈轟擊法)、電擊法、顯微注射法等，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以易操作、低費(fèi)用、插入片段拷貝數(shù)低、不產(chǎn)生嵌合體、遺傳較穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用。 本研究通過同源序列法分別從油菜(Brassi

2、ca napus)中克隆熱休克蛋白基因HSP81.1上游的啟動子序列、從哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中克隆出細(xì)胞色素酶基因P450上游的啟動子序列，其中HSP81.1基因啟動子長2169bp，P450基因啟動子長2186bp，將這兩個(gè)啟動子分別與報(bào)告基因GUS融合并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，得到轉(zhuǎn)基因煙草植株，組織化學(xué)分析表明，油菜熱休克蛋白HSP81.1：基因在煙草中具有高溫誘導(dǎo)表達(dá)的能力。熱激處理后，不同生長時(shí)期的T1代轉(zhuǎn)基因煙草GUS染色

3、深淺不同，而且在煙草生長至50天時(shí)啟動子活性最高，而擬南芥細(xì)胞色素酶P450基因在煙草中并不存在空間特異性，在煙草的根、莖、葉都有不同程度的表達(dá)。 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因作物的生物安全性問題在近年來受到人們的廣泛關(guān)注，其中有較大爭議的就是篩選標(biāo)記基因，對于轉(zhuǎn)基因植株來說，篩選標(biāo)記基因在獲得目的轉(zhuǎn)基因植株后已無用處。但這些隨目的基因整合進(jìn)去的篩選標(biāo)記基因卻存在潛在的生物安全性問題，如抗除草劑基因是否會造成超級雜草的出現(xiàn)而影響生

4、態(tài)平衡；抗生素標(biāo)記基因是否會通過食物轉(zhuǎn)移至人、畜腸道微生物中，影響抗生素治療的效果。鑒于對轉(zhuǎn)基因作物選擇標(biāo)記的安全性考慮，本研究構(gòu)建了便于標(biāo)記基因刪除的位點(diǎn)特異性載體Cre/loxP系統(tǒng)，分別用熱休克蛋白HSP81.1基因啟動子和泛組織表達(dá)的花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子表達(dá)Cre酶基因；使用花椰菜花葉病毒CaMV35S啟動子表達(dá)GFP報(bào)告基因，該載體的選擇標(biāo)記bar基因置于兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)之間，將三個(gè)載體分別通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法

5、導(dǎo)入煙草，并得到大量轉(zhuǎn)基因煙草植株，將含有Cre酶基因的轉(zhuǎn)基因煙草和含有l(wèi)oxP位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行雜交，獲得無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因煙草。 轉(zhuǎn)基因作物的安全性問題不僅僅表現(xiàn)在選擇標(biāo)記基因上，轉(zhuǎn)基因作物也可能成為超級雜草，而且有可能對近緣物種和野生種帶來潛在的影響。由于轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物的生長期、花期、花時(shí)相同或相似，所以產(chǎn)生基因漂流的機(jī)會很大。另外，由于大多數(shù)轉(zhuǎn)基因作物與非轉(zhuǎn)基因作物的種子在外觀上難以區(qū)別，因此容易混雜在一起而

6、被傳播，可能會帶來難以預(yù)測的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究從油菜( MS8RF3)基因組DNA中克隆出了解淀粉芽孢桿菌核糖核酸酶基因Bamase，將Bamase基因分別置于種子特異性表達(dá)的啟動子PNap和細(xì)胞色素酶P450啟動子的下游，成功構(gòu)建了載體pBILoxp2 PNap TAibamase、pBILoxp2 P450TAibamase和pC1300 PNap Barstar L Bamase，分別將這三個(gè)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入煙草，其中