骨骼肌脫細胞基質(zhì)再生性實驗研究.pdf

1、背景：
　　外傷事故、腫瘤切除、退行性疾病導(dǎo)致骨骼肌損傷，會造成大面積骨骼肌缺損(VML)，發(fā)病率較高，治療方法卻有限。雖然人體骨骼肌在損傷后有強大的再生能力，但是這種再生反應(yīng)依賴肌肉損傷的嚴重性。一般來說，如果超過20％肌肉的喪失，那么自然修復(fù)過程就會失敗，并且導(dǎo)致疤痕組織形成，缺損處遠端肌肉去神經(jīng)化，導(dǎo)致功能喪失。明顯，需要更好的治療方法，當骨骼肌受到創(chuàng)傷時，可以促進骨骼肌自身修復(fù)和再生，并且能夠誘導(dǎo)肌肉的合成功能。
　

2、　把干細胞接種到全器官脫細胞基質(zhì)中，獲得組織工程肺、肝和心臟以供活體植入，是能夠?qū)崿F(xiàn)的。骨骼肌占到了人體的40-50％，肌肉骨骼的創(chuàng)傷，包括大面積缺損，是很常見的。由于骨骼是功能單一的器官，通過把干細胞接種到骨骼肌支架(ECM)，來獲取組織工程肌肉應(yīng)該比較容易。最近的研究表明，來源于同源組織的肝臟和肺臟生物學支架可能比非特異組織更加適合于組織重構(gòu)。迄今為止，人們已經(jīng)多次嘗試對骨骼肌ECM進行脫細胞，但至今尚未報道獲得完整的帶有血管網(wǎng)的細

3、胞外基質(zhì)。
　　來自器官脫細胞的細胞外基質(zhì)(ECM)補片有廣闊的前景，將會越來越多的生物材料應(yīng)用到組織工程領(lǐng)域。骨骼肌脫細胞基質(zhì)很少被報道及描述，骨骼肌細胞外基質(zhì)(PM-ECM)修補大面積肌肉缺損的生物活性及功能還不是很清楚。在目前研究中，PM-ECM來源于腹直肌(RA)，豬的腹直肌灌注脫細胞技術(shù)能夠有效的將細胞及重要物質(zhì)分離出去，并且保留原有腹直肌復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)和血管網(wǎng)絡(luò)，且保留了部分生物活性物質(zhì)及機械性能。我們?yōu)槭裁催x擇豬的腹

4、直肌作為原材料，先看下豬腹直肌的解剖。(1)腹直肌結(jié)構(gòu):腹直肌常被用作肌肉瓣、肌皮瓣、帶蒂皮瓣瓣或游離瓣，不受大小或形態(tài)的限制，這使得它具有了大量的臨床用途，包括乳房切除術(shù)后的重建，胸壁重建，咽部或食道重建，局部晚期軟組織肉瘤切除后的重建，頭部和頸部區(qū)域的重建手術(shù)。腹直肌是相對獨立的骨骼肌，其周圍環(huán)繞著腹直肌鞘，血供豐富。腹直肌的動脈血管是由腹壁上動脈（位于第七肋骨處的胸廓內(nèi)動脈的分支）和腹壁下動脈（髂外動脈的分支）組成的。腹壁下動脈支

5、配經(jīng)腹直肌和后鞘，在臍部分成若干支血管與腹壁上動脈匯合。4、5肋間動脈后方的末端分支和腰動脈以及腹壁下動脈之間，也有血管的匯合。按照解剖學的觀點，豬的腹直肌與人的十分相似，包括周圍的結(jié)構(gòu)和內(nèi)部血管的分支方式。(2)腹直肌的結(jié)構(gòu)和血管:最小的收縮單位是肌纖維，它是圓柱形的、多核、肌小管組成每一束肌纖維被肌內(nèi)膜包裹，大約20-80個平行肌纖維裹在一起形成肌束或纖維從，被肌束膜包裹，它比肌內(nèi)膜厚，肌肉由很多肌束形成，外面被外在的膠原覆蓋，稱為

6、肌外膜。肌肉的主要血管沿長軸分布，滋養(yǎng)血管從右側(cè)或斜面從主干血管進入肌外膜，小動脈進入肌束膜后垂直進入肌纖維，發(fā)出終末血管進入肌束膜后成為毛細血管，無數(shù)的毛細血管嵌入肌內(nèi)膜，供應(yīng)平行的肌纖維。毛細血管在肌肉中直徑大約4um.毛細血管后靜脈管徑稍粗，不是來源伴行的靜脈，而是來之動脈。
　　目的：
　　從豬的腹直肌(RA)灌注脫細胞得到PM-ECM支架;比較PM-ECM與SIS材料的理化特性，完成體外種植C2C12細胞試驗評估;

7、建立SD大鼠腹壁缺損模型，比較PM-ECM與SIS補片的修復(fù)效果，重點在于組織的重構(gòu)、血管再生及生物相容性，為尋求理想的生物材料提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分 豬的腹直肌(RA)灌注脫細胞基質(zhì)PM-ECM支架的制備及評估
　　1.完成豬腹直肌取材，按灌注脫細胞的流程制備腹直肌脫細胞基質(zhì)(PM-ECM)。
　　2.制備SIS補片
　　3.檢測PM-ECM中DNA、SDS、GAG、bFGF、EGFR的

8、含量，與SIS補片進行比較，免疫組化實驗標識層連接蛋白、Ⅳ膠原蛋白、纖維連接蛋白，電鏡下觀察基質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，檢驗PM-ECM脫細胞的徹底性。
　　4.檢測PM-ECM的生物力學情況。
　　第二部分 PM-ECM支架體外生物活性檢測及評估
　　1.體外C2C12種植PM-ECM、SIS降解產(chǎn)物培養(yǎng)基上，小室法觀察在不同基質(zhì)濃度下C2C12遷移情況。
　　2.比較C2C12細胞在PM-ECM、SIS降解產(chǎn)物培養(yǎng)基中的分

9、化及增殖情況
　　3.使用Alamar-blue法觀察C2C12細胞在PM-ECM、SIS表面的代謝情況。
　　第三部分 PM-ECM、SIS修復(fù)大鼠腹壁缺損模型的效果及評估
　　1.將36只SD大鼠隨機分成6組，每組6只，人為制造腹壁缺損模型，分別采用PM-ECM、SIS修補缺損，設(shè)置空白對照。
　　2.術(shù)后觀察有無死亡，有無無傷口破裂或手術(shù)部位感染。無修復(fù)區(qū)腹壁松弛或瘺管形成。
　　3.第2周、8周分別

10、處死，觀察有無血清腫發(fā)生，切下修復(fù)區(qū)的標本送組織切片，觀察修復(fù)區(qū)域肌纖維、血管、神經(jīng)細胞的再生情況以及補片的皺縮及松弛情況。
　　結(jié)果：
　　1.骨骼肌灌注脫細胞徹底，SKWOACM的組織學和掃描電鏡檢查均未見任何細胞結(jié)構(gòu)和成分，DAPI染色陰性;在完全冷凍干燥的PM-ECM中DNA含量低于500ng/mg，據(jù)此計算天然骨骼肌中99.5％的DNA已被清除;殘留DNA均為短鏈DNA（200-500bp）;符合脫細胞金標準。②無

11、殘留化學物質(zhì)、消毒滅菌不影響其生物學特性。③保留了天然骨骼肌細胞外基質(zhì)三維平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu)，骨骼肌基底膜貼附于肌內(nèi)膜內(nèi)面。④保留有主干血管和毛細血管網(wǎng)絡(luò)，可見終末動脈和伴行的2條終末靜脈;組織結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)部的血管基質(zhì)網(wǎng)絡(luò)能耐受經(jīng)支配血管灌注的300mmHg高壓液體而僅有遠切端少許滲漏。⑤保留有脫細胞的肌肉-肌腱接頭結(jié)構(gòu)，可直接傳導(dǎo)力學。⑥PM-ECM保留有多種生物活性成分:免疫組化染色證實PM-ECM中含

12、有骨骼肌基底膜主要成分蛋白如Ⅳ型膠原、層連蛋白、纖維連接蛋白。⑦PM-ECM可制成多種形式衍生物，包括薄片、微粒、流體化組合物、凝膠;生物力學測試，PM-ECM的極限抗拉強度類似于天然肌肉，PM-ECM相比SIS具有更大抗拉強度。
　　2.PM-ECM濃度為50μg/ml時即達到促成肌細胞趨化最佳效果、在濃度50μg/ml時即達到促成肌細胞增殖和分化最佳效果，體外實驗結(jié)果PM-ECM組優(yōu)于SIS組，同時也證明PM-ECM降解產(chǎn)物在

13、體外能促進成肌細胞的分化、增殖及代謝活動。
　　3.PM-ECM、SIS修復(fù)大鼠腹壁缺損模型(VML)，通過觀察生物補片修補血清腫發(fā)病率高，PM-ECM修補區(qū)域的在新生血管生成、肌纖維生長、神經(jīng)纖維細胞生成、肌肉再生以及補片皺縮方面都優(yōu)于SIS補片，PM-ECM具有良好的生物安全性，證實PM-ECM在大鼠體內(nèi)修復(fù)腹壁缺損是安全、可行的。
　　結(jié)論：
　　1.骨骼肌血管灌注脫細胞徹底;PM-ECM保留了天然骨骼肌細胞外基

14、質(zhì)三維平行排列、周期性的肌外膜、肌束膜和肌內(nèi)膜超微結(jié)構(gòu);保留了GAG、bFGF、EGFR等生物活性因子;2.PM-ECM體外評估實驗，觀察C2C12細胞在PM-ECM、SIS降解成分的培養(yǎng)基中遷移、分化及增殖過程，PM-ECM濃度為50μg/ml時即達到促成肌細胞趨化最佳效果、在濃度50μg/ml時即達到促成肌細胞增殖和分化最佳效果，體外實驗結(jié)果PM-ECM組優(yōu)于SIS組，同時也證明PM-ECM降解產(chǎn)物在體外能促進成肌細胞的分化、增殖及