長(zhǎng)非編碼RNA LncTSG1抑制肝癌轉(zhuǎn)移的功能及機(jī)制研究.pdf

1、目的:肝癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多因素參與的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程。長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(Long non-coding RNA，LncRNAs)是指不具備蛋白編碼能力的，長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的RNA轉(zhuǎn)錄本。LncRNA參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、基因組穩(wěn)定性等多種生理過(guò)程，其異常表達(dá)與多種疾病密切相關(guān)，包括腫瘤。因此，尋找到肝癌中異常表達(dá)的LncRNA，揭示其在肝癌中的生物學(xué)功能及調(diào)節(jié)的信號(hào)通路，對(duì)闡明肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)

2、制、發(fā)現(xiàn)潛在的診斷和治療靶點(diǎn)具有重要意義。
　　方法:采用晶芯(R)lncRNA芯片檢測(cè)16對(duì)肝癌及癌旁組織中LncRNA的表達(dá)，篩選表達(dá)差異的LncRNA。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)LncTSG1在肝癌組織與癌旁組織中的表達(dá)水平，進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果。通過(guò)RACE技術(shù)鑒定LncTSG1的5'和3'序列，進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)并擴(kuò)增LncTSG1全長(zhǎng)。通過(guò)在肝癌細(xì)胞中上調(diào)/下調(diào)LncTSG1的表達(dá)水平，檢測(cè)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響。

3、通過(guò)生物信息學(xué)分析技術(shù)及RNA Pull Down聯(lián)合質(zhì)譜分析、RIP等實(shí)驗(yàn)方法尋找LncTSG1相互作用蛋白及調(diào)節(jié)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。
　　結(jié)果:采用晶芯(R)lncRNA芯片對(duì)16對(duì)肝癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的LncRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，分析發(fā)現(xiàn)和癌旁組織相比，LncTSG1在肝癌組織中表達(dá)顯著下降。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)43對(duì)肝癌組織及相應(yīng)癌旁組織中LncTSG1的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于癌旁組織LncTSG1在肝癌組織中的表達(dá)水平顯

4、著下調(diào)，與芯片結(jié)果一致。通過(guò)RACE技術(shù)鑒定出LncTSG1的5'端和3'端序列，并成功擴(kuò)增出LncTSG1的全長(zhǎng)，與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比對(duì)，結(jié)果顯示5'端序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的序列一致，3'端序列較數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋的序列少約100bp。
　　對(duì)表達(dá)譜芯片結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LncTSG1與參與EMT及細(xì)胞遷移相關(guān)的信號(hào)通路關(guān)系密切。通過(guò)在肝癌細(xì)胞中上調(diào)/下調(diào)LncTSG1的表達(dá)，進(jìn)行相應(yīng)的細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，通過(guò)轉(zhuǎn)染LncT

5、SG1的重組質(zhì)粒上調(diào)LncTSG1表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力降低;通過(guò)siRNA干擾下調(diào)LncTSG1的表達(dá)后，肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)，而增殖能力無(wú)明顯變化。同時(shí)，下調(diào)LncTSG1可促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變。
　　熒光原位雜交及細(xì)胞組分分離技術(shù)證實(shí)LncTSG1主要定位于細(xì)胞漿。采用生物信息學(xué)方法分析并通過(guò)RIP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LncTSG1可與AGO2結(jié)合，提示LncTSG1在胞漿中可作為ceRNA發(fā)揮作用。通過(guò)預(yù)測(cè)軟件

6、分析可能與LncTSG1結(jié)合的micoRNA，并通過(guò)文獻(xiàn)檢索，發(fā)現(xiàn)has-miR-372和has-miR-10b與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，是LncTSG1潛在調(diào)控靶點(diǎn)。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)二者下游靶基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)抑制LncTSG1的表達(dá)能夠顯著下調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因ARHGAP6、CELF2、MAPK10、TNS1、SYNPO2的表達(dá)，表明LncTSG1可能通過(guò)干擾has-miR-372和has-miR-10b對(duì)下游mRNA的調(diào)控來(lái)發(fā)揮c