血管生成素2對(duì)胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、【目的】
　　神經(jīng)干細(xì)胞（Neural stem cells,NSCs）具有多向分化能力，可代償損傷后的神經(jīng)細(xì)胞并重建被破壞的神經(jīng)系統(tǒng)環(huán)路，被廣泛認(rèn)為是可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system,CNS）損傷，如脊髓損傷（Spinal cord injury,SCI）,最具潛力的種子細(xì)胞。然而，如何調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的分化及分化方向，促進(jìn)其向神經(jīng)元方向分化，進(jìn)而最大化修復(fù)受損神經(jīng)組織，仍是當(dāng)前亟待解決的重大問

2、題。近年的研究發(fā)現(xiàn)，曾被認(rèn)為是僅參與生理性和病理性血管形成的血管生成素2（Angiopoietin2,Ang2），在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及再生修復(fù)的過程中亦發(fā)揮著重要的促進(jìn)性作用。本課題通過分離培養(yǎng)E12.5天的胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞，研究Ang2對(duì)胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化作用及分化方向；并進(jìn)一步研究其誘導(dǎo)分化作用的分子機(jī)制，應(yīng)用PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路特異性抑制劑，觀察Ang2對(duì)胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化作用的改變，探討

3、PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在Ang2誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化作用中的關(guān)鍵機(jī)制。
　　【方法】
　　本實(shí)驗(yàn)首先對(duì)C57BL/6J胎鼠（E12.5天）腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行原代分離、培養(yǎng)與純化，通過體外培養(yǎng)形態(tài)學(xué)觀察、Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定、以及神經(jīng)干細(xì)胞分化能力的鑒定；改良凍存與復(fù)蘇神經(jīng)干細(xì)胞的配方與方法，并對(duì)經(jīng)過不同凍存時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞（0，1，6，12月）進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及分化能力的鑒定。實(shí)驗(yàn)使用經(jīng)過兩代無血清培養(yǎng)

4、純化后的神經(jīng)干細(xì)胞，將其接種于包被有多聚賴氨酸（Poly-L-lysine,PLL）的培養(yǎng)孔板及培養(yǎng)皿中，使用含有Ang2的分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）、免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫印跡試驗(yàn)（Westernblot）等技術(shù)，觀察Ang2對(duì)胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化方向及分化效率，并使用Image-Pro Plus6.0軟件及Quantity One軟件量化、比較神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)

5、細(xì)胞的分化比例。同時(shí)通過免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Western blot、流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytomery）等技術(shù)，利用PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002與Rapamycin，觀察 Ang2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向誘導(dǎo)分化作用的改變，研究PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在Ang2誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞分化作用中的機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　實(shí)驗(yàn)成功分離純化胎鼠（E12.5天）腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞，通過形態(tài)學(xué)

6、觀察、Nestin與神經(jīng)干細(xì)胞分化能力的免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定，證實(shí)其具有神經(jīng)干細(xì)胞特性；改良后的凍存與復(fù)蘇神經(jīng)干細(xì)胞配方與方法有效，經(jīng)過不同凍存時(shí)間的神經(jīng)干細(xì)胞（0,1,6,12月）形態(tài)一致，神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的分化能力無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）。通過使用針對(duì)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的特異性細(xì)胞標(biāo)志物（βⅢ-tubulin，MAP2;GFAP;CNPase）進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色及Western b

7、lot檢測(cè)，證實(shí)經(jīng)過Ang2誘導(dǎo)處理的神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的細(xì)胞比例及蛋白表達(dá)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.001;p<0.001），而神經(jīng)干細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞分化的細(xì)胞比例與蛋白表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的改變（p>0.05;p>0.05）。利用PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002與Rapamycin，證實(shí)mTOR作為PI3K-AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，介導(dǎo)Ang2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方

8、向的誘導(dǎo)分化。
　　【結(jié)論】
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Ang2具有顯著促進(jìn)E12.5天的胎鼠腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化的作用，同時(shí)不影響其向星形膠質(zhì)細(xì)胞及少突膠質(zhì)細(xì)胞方向的分化；PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路在Ang2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化方向的調(diào)控作用中發(fā)揮重要作用，mTOR作為PI3K-AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，介導(dǎo)Ang2對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向的誘導(dǎo)分化作用。課題證實(shí)Ang2調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化及其分化方向，提高神經(jīng)干細(xì)胞向