CD9在表皮細胞移行調(diào)節(jié)中的作用及機制研究.pdf

1、背景:
　　創(chuàng)面愈合是一個動態(tài)且受到嚴格精準調(diào)控的生物學過程。再上皮化主要涵蓋表皮細胞向面中心遷移的過程，是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。TetraspaninCD9表達于皮膚表皮中且我們前期通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)CD9基因敲除小鼠皮膚創(chuàng)面愈合速度明顯受抑制，表明CD9參與皮膚創(chuàng)面愈合的調(diào)控。然而，皮膚損傷后可激活多條細胞內(nèi)及細胞間的信號通路，且包括角質(zhì)化細胞，炎性細胞，內(nèi)皮細胞，成纖維細胞等在內(nèi)的多種細胞類型也會被調(diào)動參與創(chuàng)面愈合過程。這些

2、細胞均會在基因表達或細胞表型上發(fā)生改變，促進細胞增殖、遷移或分化等過程，以參與創(chuàng)面愈合過程。因此，CD9是否通過調(diào)節(jié)表皮細胞遷移及其胞內(nèi)信號通路介導創(chuàng)面愈合調(diào)控仍不清楚。
　　大量研究表明基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-9)參與創(chuàng)面愈合過程中表皮細胞遷移的調(diào)控。我們前期研究結(jié)果也表明CD9下調(diào)可通過激活MMP-9介導表皮細胞遷移的調(diào)節(jié)。Tetraspanins分子家族的重要特征之一就是同整合素分子結(jié)合，并啟動下游信號通路。CD9也被發(fā)現(xiàn)在

3、創(chuàng)面愈合過程中受到嚴密的調(diào)控并參與整合素分子的調(diào)節(jié)。整合素αvβ6被證明可促進角膜創(chuàng)面愈合、上調(diào)MMP-9并可促進正?？谇火つけ砥ぜ毎w移。有證據(jù)表明皮膚創(chuàng)面愈合過程中再上皮化過程同整合素αvβ5及αvβ6間的轉(zhuǎn)換有關(guān)。此外，在創(chuàng)面愈合過程中或皮膚表皮細胞角化過程中，表皮細胞均存在分化狀態(tài)及運動性間平衡的調(diào)節(jié)。而我們前期研究也證明CD9可通過在創(chuàng)面愈合不同的階段的差異性表達介導表皮細胞遷移的調(diào)節(jié)。
　　雖然CD9被證明參與創(chuàng)面再上

4、皮化過程且在皮膚創(chuàng)面愈合過程中其表達水平受嚴格的時空調(diào)控，即創(chuàng)面形成后其表達明顯下調(diào)，當創(chuàng)面再上皮化完成時其表達又恢復至正常皮膚表皮中水平，然而CD9在創(chuàng)面愈合過程其表達調(diào)控的具體機制也仍不清楚。事實上，急性皮膚組織損傷后創(chuàng)面微環(huán)境呈低氧環(huán)境且創(chuàng)緣組織氧濃度的這一變化過程同創(chuàng)面愈合過程中CD9的表達變化成良好的契合。
　　因此，本研究將檢測CD9對表皮細胞遷移的影響，并進一步探討創(chuàng)面愈合過程中CD9對表皮細胞中MMP-9表達的調(diào)節(jié)

5、以及整合素在其中的作用;同時，也將從表皮細胞分化狀態(tài)及運動性間平衡的角度探討CD9對表皮細胞移行的調(diào)控作用。此外，我們還將通過建立體外表皮細胞缺氧模型，明確創(chuàng)面愈合過程中CD9表達變化的分子機制，從而揭示CD9調(diào)節(jié)創(chuàng)面表皮細胞移行的作用機理，為揭示創(chuàng)面愈合規(guī)律的認識提供新的視角。
　　方法:
　　1.利用小鼠皮膚制作在體創(chuàng)面愈合模型，同時使用HaCaT表皮細胞及正常人皮膚角質(zhì)化細胞片層劃痕制作體外細胞創(chuàng)面愈合模型。使用免疫熒

6、光染色檢測創(chuàng)緣移行表皮細胞中CD9的表達變化。使用重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)制作CD9高表達或干擾表達的表皮細胞模型，然后進行劃痕檢測及細胞遷移分析以觀察CD9對表皮細胞遷移的影響。此外，還利用明膠酶譜法及ELISA法檢測CD9調(diào)控的表皮細胞培養(yǎng)上清液中MMP-9的活性變化，并利用蛋白免疫印跡法檢測細胞中MMP-9的表達變化。MMP-9的選擇性抑制劑或SP600125(10μM)被用來處理表皮細胞，以檢測MMP-9在CD9調(diào)節(jié)的表皮細胞遷移中的

7、作用或用來檢測JNK信號通路在CD9介導MMP-9調(diào)節(jié)中的作用。
　　2.同上述方法制作CD9高表達或干擾表達的HaCaT表皮細胞模型，然后運用WB法檢測CD9調(diào)控后的HaCaT表皮細胞中整合素亞基的表達變化。同時提取HaCaT表皮細胞的細胞膜蛋白使用免疫共沉淀技術(shù)檢測整合素亞基間的結(jié)合變化。免疫熒光染色及流式細胞學技術(shù)均被用來檢測表皮細胞膜上整合素αvβ5及αvβ6的分布變化。另外，整合素功能阻斷劑10D5和P1F6(10μg/

8、ml)也被分別用來觀察整合素αvβ5或αvβ6在CD9介導的表皮細胞MMP-9激活及遷移中的作用。
　　3.HaCaT表皮細胞及原代小鼠皮膚表皮細胞(MKs)進行高鈣處理(1.2 mM)24h建立表皮細胞分化模型，然后使用WB法檢測CD9的表達變化。使用活細胞工作站動態(tài)拍攝技術(shù)觀察單個表皮細胞的運動性，并使用Image J軟件進行分析;CD9高表達或干擾表達MKs分別于低鈣或高鈣條件下培養(yǎng)24h，觀察CD9對表皮細胞直徑及鋪展面積

9、的影響，同時使用WB法檢測分化標記物(CK1，CK10，loricrin和filaggrin)的表達變化。免疫熒光染色被用來觀察E-cadherin介導的細胞間粘附，而WB法及IP技術(shù)被用來檢測CD9調(diào)控的表皮細胞中PI3K信號通路激活情況。使用E-cadherin siRNA或LY294002處理低鈣條件培養(yǎng)的CD9高表達表皮細胞，以觀察其對CD9調(diào)控的表皮細胞分化及運動性的影響。使用JNK信號通路抑制劑SP600125處理CD9干擾

10、表達的表皮細胞以檢測JNK信號通路在E-cadherin向細胞膜上募集中的作用。此外，IHC法觀察CK10及E-cadherin在CD9基因敲除的小鼠皮膚表皮細胞膜上表達變化。
　　4.HaCaT表皮細胞及原代小鼠皮膚表皮細胞(MKs)進行缺氧處理(2％ O2)12h、24h及36h，然后使用WB及real-timePCR技術(shù)檢測CD9水平變化。重組腺病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)制作CD9高表達或干擾表達的HaCaT表皮細胞模型再進行缺氧處理，然

11、后使用劃痕法及活細胞工作站動態(tài)攝像技術(shù)觀察CD9對缺氧HaCaT細胞的作用。WB法檢測p38/MAPK信號通路激活情況并使用SB203580或MKK6(Glu)轉(zhuǎn)染調(diào)節(jié)缺氧表皮細胞中p38/MAPK信號通路后，WB法檢測CD9表達變化。同時使用細胞劃痕分析及細胞遷移分析法檢測p38/MAPK信號通路在CD9調(diào)節(jié)的缺氧表皮細胞遷移中的作用。
　　結(jié)果:
　　1.在體或離體創(chuàng)面愈合模型中創(chuàng)緣移行表皮細胞中CD9的表達均下調(diào)，且C

12、D9的下調(diào)表達可促進表皮細胞移行，而CD9的高表達作用則相反。CD9可負向調(diào)控表皮細胞中MMP-9的活性及蛋白水平。CD9低表達激活的.JNK信號通路也參與上調(diào)表皮細胞中MMP-9的活性及表達，而SP600125抑制JNK信號通路后卻可使CD9干擾的表皮細胞中MMP-9活性及蛋白水平下調(diào)。
　　2.CD9可調(diào)節(jié)表皮細胞中β5和β6的表達，且CD9干擾后可促進表皮細胞中αvβ5向αvβ6的轉(zhuǎn)換，而CD9高表達卻可逆轉(zhuǎn)這一轉(zhuǎn)換過程。使

13、用10D5對整合素αvβ6進行功能阻斷后可顯著抑制CD9下調(diào)誘導的表皮細胞遷移及MMP-9激活。
　　3.分化的表皮細胞中CD9的表達明顯提高;且CD9高表達可促進表皮細胞分化并抑制其運動性;而CD9干擾后可抑制高鈣誘導的表皮細胞分化過程并提高細胞的運動性。CD9上調(diào)后可促進E-cadherin向細胞膜上募集并激活下游PI3K信號通路，而CD9干擾后可抑制這一過程。另外，E-cadherin干擾后或PI3K信號通路受抑后均可逆轉(zhuǎn)C

14、D9上調(diào)誘導的表皮細胞分化及運動性下降。
　　4.缺氧可下調(diào)CD9在表皮細胞中的表達水平并促進細胞遷移;而CD9高表達可抑制缺氧促進的表皮細胞遷移作用。缺氧還可激活p38/MAPK信號通路;使用SB203580可上調(diào)表皮細胞中CD9的蛋白水平并下調(diào)缺氧條件下表皮細胞的遷移速率;而使用MKK6(Glu)腺病毒轉(zhuǎn)染促進p38/MAPK信號通路激活后，卻可使CD9表達下調(diào)并促進缺氧條件下表皮細胞的遷移。
　　結(jié)論:
　　1.

15、CD9在體內(nèi)及體外創(chuàng)面愈合模型的移行表皮細胞中均呈下調(diào)表達，且CD9的低表達可促進表皮細胞的遷移，MMP-9參與了CD9介導的表皮細胞遷移調(diào)控，激活JNK通路可使MMP-9活化，顯著促進CD9介導的表皮細胞遷移。
　　2.下調(diào)CD9表達可促進皮膚表皮細胞中整合素αvβ5向αvβ6的轉(zhuǎn)化，而整合素αvβ5和αvβ6間的轉(zhuǎn)換在CD9介導的表皮細胞遷移及MMP-9激活調(diào)節(jié)過程中均起重要作用。
　　3.CD9可調(diào)控表皮細胞分化狀態(tài)及