Riboswitch cDNA體外組裝及相關(guān)文庫構(gòu)建.pdf

1、Riboswitch稱為核糖開關(guān),廣泛存在于各種生物體內(nèi),可以認為是一類對小分子代謝物敏感的結(jié)構(gòu)RNA,通過結(jié)合小分子代謝物在轉(zhuǎn)錄與翻譯水平調(diào)控基因表達。它們通常位于mRNA的5'-非翻譯區(qū)(5'-untranslated regions UTR),不編碼蛋白質(zhì),可以不依賴任何蛋白因子而直接結(jié)合小分子代謝物,繼而發(fā)生構(gòu)象重排,影響該mRNA的活動,調(diào)控小分子代謝物相關(guān)蛋白的表達。特異性與之結(jié)合的小分子代謝物一般為賴氨酸(Lysine),

2、黃素單核苷酸(flavin mononucleotide,FMN),硫胺素焦磷酸(Thiamine pyrophosphate,TPP),甘氨酸(glycine),維生素B12氰鈷銨(Cobalamin)等,其中與小分子結(jié)合的區(qū)域稱為適配體結(jié)構(gòu)域(aptamer domain,AD)。
　　 合成生物學(xué)的發(fā)展使得基因的人工合成變?yōu)榭赡堋Ｓ捎诶脗鹘y(tǒng)的堿基按序合成的方法來合成各種預(yù)期目的基因或者基因組序列既浪費時間又浪費資金,并且

3、合成的目標序列有著很高的出錯率,同時在多元平行構(gòu)建基因的過程中,需要大量合成短的寡核苷酸(oligos)。隨著科技的發(fā)展,微流體芯片技術(shù)的應(yīng)用可以使我們平行合成寡核苷酸的過程變的相對簡單與高效。由此可使得人工合成基因的過程簡化為連接組裝寡核苷酸片段。
　　 本論文以可程序控制的微流體PicoArray芯片平行合成的多元Riboswitch寡核苷酸(這些多元寡核苷酸經(jīng)過人為設(shè)計和改良)為材料,通過擴增回收純化,混合成為寡核苷酸混合

4、物(OligoMix),酶切純化,連接與組裝,PCR擴增,電泳檢測等過程組裝全長的Riboswitch基因。通過對合成目的基因與載體的連接,轉(zhuǎn)化,克隆,提取質(zhì)粒,進而對體外組裝結(jié)果進行驗證。通過質(zhì)粒抽提,PCR,目的片段的回收純化與檢測,含量檢測,獲取Riboswitch目的基因的相關(guān)數(shù)據(jù)。將Riboswitch文庫中DNA分子所對應(yīng)的RNA序列進行M-fold二級結(jié)構(gòu)折疊預(yù)測。通過文獻查閱,按照配體的不同對Riboswitch分類,進