c-Myc及CyclinA2基因誘導大鼠耳蝸前體細胞增殖的體外研究.pdf

1、在成年哺乳動物耳蝸中，聽覺毛細胞和神經(jīng)元損傷后不能再生，這成為感音神經(jīng)性聾難以治愈的主要原因。近年來，自新生鼠耳蝸分離出前體細胞，在體外可定向分化為表達毛細胞和螺旋神經(jīng)元表型的細胞。我們在體外比較了P1、P7和P14的大鼠耳蝸前體細胞的數(shù)量、增殖能力及超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明出生后耳蝸前體細胞大部分處于細胞周期的靜止期，并逐步通過分化和凋亡徹底地退出了細胞周期，耳蝸前體細胞也并非真正意義上的干細胞，而是處于干細胞與成熟子代細胞之間的中間細胞或

2、是處于干細胞未端的細胞。通過實驗發(fā)現(xiàn)c-Myc可能參與調(diào)控耳蝸的發(fā)育以及前體細胞的增殖、分化。結(jié)合之前的工作基礎(chǔ)，我們利用腺病毒技術(shù)將c-Myc和cyclinA2共轉(zhuǎn)染至新生鼠耳蝸前體細胞，可使其增殖，并促進前體細胞重新進入細胞周期。初步研究其調(diào)控機制，表明為經(jīng)典的CKI-cyclin-CDK途徑。
　　實驗一大鼠耳蝸前體細胞的分離、培養(yǎng)
　　目的：對新生大鼠耳蝸前體細胞進行分離、培養(yǎng)。
　　方法：從P7大鼠耳蝸中分離

3、、培養(yǎng)前體細胞，用免疫細胞化學的方法對前體細胞進行鑒定；血清誘導分化后鑒定分化潛能，進一步了解其多向分化特性。
　　結(jié)果：原代培養(yǎng)的細胞，培養(yǎng)1天后即可見“細胞球”，隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，可見細胞球體積增大，所含細胞增多；培養(yǎng)5天后，少部分細胞球內(nèi)的細胞出現(xiàn)分化及貼壁現(xiàn)象。細胞球內(nèi)大部分細胞呈nestin、musashi1和BrdU陽性，表明其具有自我更新及有絲分裂的能力。細胞球經(jīng)誘導分化14d后，對分化細胞行免疫細胞化學鑒定，發(fā)現(xiàn)

4、分化細胞表達毛細胞標志物myosinVIIA和phalloidin，表達成熟神經(jīng)元標志物NeuN，表達不成熟神經(jīng)元標志物Tuj1，表達星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP，表達少突膠質(zhì)細胞標志物galactocerebroside，以及谷氨酸能神經(jīng)元標志物GluR-1，證明其具有多向分化潛能。
　　結(jié)論：本部分實驗為研究耳蝸前體細胞成年后“沉默”的機制奠定基礎(chǔ)，為研究通過基因治療的方法促進前體細胞增殖提供了一種體外模型。
　　實驗二不

5、同日齡大鼠耳蝸前體細胞增殖能力及超微結(jié)構(gòu)的比較
　　目的：耳蝸前體細胞在成年后沉默或消失的具體機制尚不清楚，為探討其原因，我們在體外比較了P1、P7和P14的大鼠耳蝸前體細胞的數(shù)量、增殖能力及超微結(jié)構(gòu)，觀察耳蝸前體細胞的轉(zhuǎn)歸。
　　方法：對P1、P7和P14分離出的耳蝸前體細胞，經(jīng)體外培養(yǎng)7天后進行計數(shù)，檢測其數(shù)量變化，并每隔5天傳代觀察傳代數(shù)；采用流式細胞技術(shù)檢測細胞周期，來評估不同日齡新生大鼠耳蝸前體細胞增殖能力的變化；

6、應用透射電鏡觀察不同日齡新生大鼠耳蝸前體細胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：出生1周后耳蝸前體細胞的數(shù)量急劇下降，出生2周后的耳蝸內(nèi)未能分離出前體細胞；P7前體細胞的傳代數(shù)較P1減少；P7較P1更多的前體細胞處于有絲分裂的靜止期，增殖指數(shù)下降；P7的前體細胞超微結(jié)構(gòu)中有更多分化細胞的特點。
　　結(jié)論：耳蝸前體細胞出生后大部分處于細胞周期的靜止期，并逐步通過分化和凋亡徹底地退出了細胞周期，他們并非真正意義上的干細胞，而是處于干細胞與成

7、熟子代細胞之間的中間細胞或是處于干細胞未端的細胞。
　　實驗三c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育和耳蝸前體細胞分化過程中的表達變化
　　目的：原癌基因c-Myc具有調(diào)控G0/G1轉(zhuǎn)換和去分化的雙重作用。目前對于c-Myc在內(nèi)耳中的功能尚未見報道。我們擬通過檢測c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育及前體細胞分化過程中的表達情況，探討其在哺乳動物耳蝸發(fā)育中的作用。
　　方法：1、取E10、E15、P1、P7和P14的SD大鼠耳蝸組織，應

8、用RT-PCR、Westernblot的方法檢測c-Myc在大鼠耳蝸組織發(fā)育過程中的表達情況。2、取耳蝸前體細胞和分化7天后的分化細胞，用RT-PCR、免疫細胞化學染色和Westernblot的方法檢測c-Myc在耳蝸前體細胞分化過程中的表達情況。
　　結(jié)果：從胚胎至出生后的耳蝸發(fā)育過程中，c-Myc表達量呈現(xiàn)逐漸下降趨勢；在前體細胞的分化過程中c-Myc的表達量也呈現(xiàn)下降。
　　結(jié)論：c-Myc的表達量在大鼠耳蝸組織發(fā)育及

9、耳蝸前體細胞分化的過程中逐漸下降，這表明c-Myc可能參與調(diào)控大鼠耳蝸組織的發(fā)育及前體細胞的分化。
　　實驗四Ad-c-Myc-EGFP和Ad-CyclinA2-EGFP的構(gòu)建和轉(zhuǎn)染耳蝸前體細胞的濃度確定
　　目的：構(gòu)建目的基因分別為c-Myc和CyclinA2的腺病毒載體，體外轉(zhuǎn)染大鼠耳蝸前體細胞，觀察轉(zhuǎn)染效率及細胞活性，確定適當?shù)霓D(zhuǎn)染濃度。
　　方法：1、構(gòu)建復制缺陷重組腺病毒：Ad-CyclinA2-EGFP、A

10、d-c-Myc-EGFP及Ad-EGFP；2、在不同效靶比濃度下（MOI=50、100、150、200、250），Ad-EGFP轉(zhuǎn)染耳蝸前體細胞，觀察不同濃度轉(zhuǎn)染時細胞形態(tài)變化，熒光顯微鏡觀察EGFP表達情況，計算陽性細胞百分率；3、應用MTT觀察細胞活性確定增殖點；4、確定MOI值，應用流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。
　　結(jié)果：毒種上清液經(jīng)PCR鑒定，能夠特異地擴增出預期大小的條帶，證明該重組腺病毒攜帶目的片段。在不同效靶比濃度下，E

11、GFP陽性細胞百分率隨MOI值的升高而增大；當MOI=50，100，150時重組腺病毒對細胞的毒性作用與對照組相比無顯著差異；當MOI值=200時，細胞狀態(tài)不佳，出現(xiàn)生長抑制。根據(jù)光鏡下細胞形態(tài)學證據(jù)，確定本實驗采用MOI值為150。經(jīng)MTT法測定，細胞生長曲線呈S形，轉(zhuǎn)染后36小時做為增殖點，應用流式細胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率為25.2％。
　　結(jié)論：復制缺陷型腺病毒可有效轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的耳蝸前體細胞，為進一步研究c-Myc和Cycli

12、nA2基因?qū)Χ伹绑w細胞增殖能力的影響奠定了基礎(chǔ)。
　　實驗五c-Myc、CyclinA2基因?qū)Χ伹绑w細胞增殖能力的影響
　　目的：耳蝸前體細胞在體外具有一定的增殖能力，可定向分化為表達毛細胞和神經(jīng)元表型的細胞，但耳蝸前體細胞增殖能力差，并處于細胞周期的“靜止”狀態(tài)。我們用編碼目的基因為c-Myc和CyclinA2的腺病毒表達載體轉(zhuǎn)染耳蝸前體細胞，促進其增殖并重返細胞周期，從而為誘導耳蝸受損細胞再生提供新的思路和依據(jù)。

13、r>　　方法：分別設(shè)立Ad-CyclinA2-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-c-Myc-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組及Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共轉(zhuǎn)染組；用復制缺陷腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠耳蝸前體細胞，MOI值為150，用流式細胞技術(shù)檢測c-Myc和CyclinA2基因?qū)Χ伹绑w細胞周期的影響；BrdU孵育觀察轉(zhuǎn)染后有絲分裂能力的變化；觀察各組傳代能力變化，采用方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。
　　結(jié)果：流式

14、結(jié)果表明Ad-CyclinA2-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-c-Myc-EGFP轉(zhuǎn)染組、Ad-EGFP轉(zhuǎn)染組對耳蝸前體細胞周期無明顯影響；而Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP共轉(zhuǎn)染組可使部分耳蝸前體細胞進入G1/S期和G2/M期，共轉(zhuǎn)染組與對照組G0/G1期細胞比例分別為62.03±2.02％、78.27±6.09％（P﹤0.05）；增殖指數(shù)分別為37.97±2.015、20.41±7.16（P﹤0.05）。共轉(zhuǎn)染組

15、中共表達綠色熒光（EGFP）、紅色熒光（BrdU陽性）及藍色熒光（Hoechst）的細胞球數(shù)量增多，表明共轉(zhuǎn)染c-Myc、CyclinA2使更多的耳蝸前體細胞具有有絲分裂的能力；各組間傳代能力無明顯變化。
　　結(jié)論：c-Myc基因和CyclinA2基因單獨作用于耳蝸前體細胞，在體外對細胞增殖與細胞周期無明顯影響。而c-Myc和CyclinA2基因共同作用于耳蝸前體細胞，可促進細胞增殖，使部分前體細胞重返細胞周期。
　　實驗六

16、c-Myc與CyclinA2基因促進耳蝸前體細胞增殖的作用機制
　　目的：研究c-Myc和CyclinA2基因共同轉(zhuǎn)染耳蝸前體細胞后，檢測目的基因表達情況以及促進細胞增殖的機制。
　　方法：應用real-timePCR和Westernblot的方法觀察轉(zhuǎn)染Ad-EGFP與共轉(zhuǎn)染Ad-CyclinA2-EGFP、Ad-c-Myc-EGFP時目的基因、PCNA、CDK2以及P27KIP1在細胞中的表達水平變化。
　　結(jié)果：

17、real-timePCR和Westernblot結(jié)果證實攜帶目的基因的腺病毒轉(zhuǎn)染耳蝸前體細胞后能有效表達出相應的mRNA和蛋白；并可升高PCNA與CDK2的表達水平，降低P27KIP1的表達水平。
　　結(jié)論：復制缺陷型腺病毒可有效介導c-Myc和CyclinA2基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的耳蝸前體細胞，并通過上調(diào)細胞周期蛋白依賴激酶CDK2，下調(diào)CDK抑制蛋白P27KIP1，進而上調(diào)細胞DNA合成期標志蛋白PCNA來實現(xiàn)耳蝸前體細胞增殖的作