特異性抗體與慢病毒介導(dǎo)RNAi抑制B7-CD28協(xié)同刺激信號對小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機制研究.pdf

1、B7分子表達在抗原遞呈細胞(antigen-presenting cell,APC)的表面，是重要的T細胞協(xié)同刺激分子，正常生理條件下，其與T細胞表面的CD28結(jié)合及傳遞適度的B7/CD28信號是啟動T細胞免疫應(yīng)答以及促進T細胞依賴的B細胞活化和功能發(fā)揮所必需的。在病理狀態(tài)下，B7/CD28信號活化過度，致使T、B細胞功能亢進和異常免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus eryt

2、hematosus,SLE)是一種慢性的自身免疫性疾病，患者機體免疫功能出現(xiàn)紊亂：T、B細胞等發(fā)生異常的免疫應(yīng)答，促進多種自身抗體形成，進而出現(xiàn)免疫復(fù)合物在各種組織器官的沉積以及不可逆轉(zhuǎn)性的炎癥損傷。在SLE眾多病理表現(xiàn)中，狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)最為常見，亦是嚴重威脅患者生命的主要并發(fā)癥，尤其受到關(guān)注。研究表明，在LN的病理過程中B7/CD28協(xié)同刺激信號參與其中，該信號通路的過度活化及導(dǎo)致的T、B細胞功能亢

3、進對于LN的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。
　　通過特異性抗體結(jié)合及封閉B7分子在蛋白水平干預(yù)B7/CD28信號通路，可中斷或者削弱T、B細胞的異常免疫應(yīng)答以及恢復(fù)機體正常的免疫耐受，對于減輕SLE的病理損傷具有積極的意義。同樣的，采用RNA干擾(RNA interference,RNAi)的方式在基因水平上特異性的沉默B7基因，進而使得APC表面缺失或下調(diào)B7分子，也可以達到對B7/CD28協(xié)同刺激信號阻斷或者抑制的目的，從而使T、B

4、細胞等異常的活化與應(yīng)答得到控制。
　　本研究采用本科室前期所建立的分泌小鼠抗人B7-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株，自行生產(chǎn)制備B7-2分子特異性抗體并對其進行體外生物學特性的鑒定，同時構(gòu)建小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒并分析驗證其對B7/CD28協(xié)同刺激信號的拮抗效應(yīng)。與此同時，建立降植烷(Pristane)誘導(dǎo)的，與人類狼瘡病理過程/癥狀類似的C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型，通過免疫細胞活化、自身抗體產(chǎn)生與免疫復(fù)合物沉積以及

5、腎臟炎癥損傷等指標檢驗?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定可靠性。在前述基礎(chǔ)之上，采用B7-2特異性抗體在蛋白水平及小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒在基因水平抑制B7/CD28協(xié)同刺激信號、影響SLE病理過程中APC-T細胞-B細胞的病理性連鎖反應(yīng)軸，對C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型實施整體免疫干預(yù)，通過免疫學、血清學及組織病理學等指標的動態(tài)檢測與分析，探究對小鼠狼瘡樣腎炎形成和病理損傷的免疫干預(yù)效應(yīng)以及相應(yīng)的分子機制，同時對不同干預(yù)方式對狼瘡小鼠腎臟病理損

6、傷的緩解/逆轉(zhuǎn)效應(yīng)進行比較，以期為SLE疾病發(fā)生發(fā)展中免疫細胞活化及病理損傷的演變過程提供新的證據(jù)，同時為此類疾病尋找新的生物學干預(yù)手段。
　　第一部分小鼠抗人B7-2分子功能性單克隆抗體的制備及生物學特性研究
　　目的：制備小鼠抗人B7-2分子功能性單克隆抗體，并對其生物學特性進行研究。
　　方法：運用小鼠抗人B7-2單克隆抗體的雜交瘤細胞株，采用誘生腹水法制備抗體；Protein G免疫親和層析法純化抗體；流式細胞

7、術(shù)檢測該抗體對不同種類細胞的膜型B7-2分子的識別能力；MTT法檢測其對B7/CD28協(xié)同刺激信號的拮抗作用。
　　結(jié)果：通過誘生腹水法進行抗體制備時腹水形成的陽性率約為80％，腹水的平均收獲量為5.5mL/只小鼠，抗體蛋白的得率平均為2.5mg/mL腹水；該抗體能夠識別L929-B7-2、Raji及小鼠脾臟細胞表面的B7-2分子，陽性結(jié)合率分別為94.5%、98.2%及52.7%；同時此抗體也能夠拮抗B7-2介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號以

8、及顯著抑制L929-B7-2刺激人外周血淋巴細胞的增殖效應(yīng)(p＜0.05)。
　　結(jié)論：成功制備了B7-2分子特異性單克隆抗體，該抗體能夠有效拮抗B7/CD28協(xié)同刺激信號。
　　第二部分小鼠B7-2基因RNAi慢病毒表達載體的構(gòu)建及重組慢病毒的制備
　　目的：構(gòu)建小鼠B7-2基因RNA干擾慢病毒表達載體，并進行重組慢病毒的制備。
　　方法：選擇三段小鼠B7-2基因RNAi的靶序列，設(shè)計合成短發(fā)夾RNA的模板，將

9、其克隆導(dǎo)入慢病毒表達載體，將篩選及鑒定的表達載體與慢病毒包裝及包膜質(zhì)粒通過脂質(zhì)體法共轉(zhuǎn)染293T細胞，從而包裝生產(chǎn)重組慢病毒；重組慢病毒通過超速離心法進行濃縮；采用細胞生物學的方法進行滴度測定以及及復(fù)制型慢病毒的檢測。
　　結(jié)果：經(jīng)測序鑒定，重組小鼠B7-2基因RNAi慢病毒表達載體構(gòu)建正確；通過慢病毒質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞包裝制備了重組慢病毒；經(jīng)超速離心獲得了濃縮的慢病毒顆粒，經(jīng)細胞生物學方法檢測證實，病毒滴度達到1～3×108

10、TU/mL，同時在重組慢病毒感染過程中無復(fù)制型病毒的產(chǎn)生，具有良好的生物安全性。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了分別針對三個不同靶點的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒表達載體，并包裝制備了具有良好生物安全性的高滴度重組慢病毒(LV-139/LV-425/LV-848)。
　　第三部分小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒對樹突狀細胞膜型B7-2分子表達的干擾效應(yīng)研究
　　目的：依據(jù)對DC膜型B7-2表達干擾效應(yīng)的差異，篩選出基因沉

11、默效果最佳的重組小鼠B7-2基因RNAi慢病毒，并檢測其對B7/CD28協(xié)同刺激信號的拮抗作用。
　　方法：從C57BL/6小鼠中分離獲得骨髓細胞，采用細胞因子(GM-CSF及IL-4)誘生法制備DC，應(yīng)用脂多糖刺激48h促進成熟，同時通過對其生長形態(tài)、表面分子表達(CD11c、B7-1、B7-2及MHCⅡ)的檢測進行鑒定；重組慢病毒LV-NC以不同感染復(fù)數(shù)(5,10,20,40,60)感染體外分離誘導(dǎo)的DC后，采用流式細胞術(shù)分析

12、感染效率并確定最佳的感染條件；重組慢病毒LV-139、LV-425及LV-848以確定的感染條件感染DC，流式細胞術(shù)檢測其對DC膜型B7-2分子表達的干擾效率并確定具有最佳干擾效果的小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒；MTT法測定小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒對B7/CD28協(xié)同刺激信號的拮抗作用和對DC刺激小鼠脾臟T細胞增殖的抑制效應(yīng)。
　　結(jié)果：成功分離誘導(dǎo)出小鼠骨髓源DC，其具有典型的樹突狀突起、表達CD11c(68.5

13、%)及B7-1(71.6%)、B7-2(74.0%)、MHCⅡ(84.0%)；經(jīng)流式細胞術(shù)分析，重組慢病毒LV-NC可以有效感染DC，感染效率達到86.4%；重組慢病毒LV-139、LV-425、LV-848在感染復(fù)數(shù)為80時，對DC膜型B7-2分子表達的干擾效率分別為66.7%、67.2%及63.8%；經(jīng)MTT法檢測，重組慢病毒LV-425能夠拮抗B7-2介導(dǎo)的協(xié)同刺激信號以及顯著抑制DC刺激小鼠脾臟T細胞的增殖效應(yīng)(p＜0.05)。

14、
　　結(jié)論：小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒LV-425可有效拮抗B7/CD28協(xié)同刺激信號。
　　第四部分小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及生物學鑒定
　　目的：建立降植烷(Pristane)誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型，并對其進行生物學鑒定。
　　方法：C57BL/6小鼠(雌性，6～8周齡)經(jīng)腹腔一次性注射Pristane0.5mL/只進行模型的制備。建模后第10天，流式細胞術(shù)分析小鼠脾臟中Mφ、DC、粒細胞及B細胞活

15、化狀況以及B細胞表面B7-2、MHCⅡ的表達情況；每個月進行眼眶經(jīng)脈叢定期活體取血以及血清中ANA及抗dsDNA抗體表達的間接免疫熒光分析；每月一次早晨收集小鼠新鮮尿液，應(yīng)用Albustix試紙測定尿蛋白含量；建模后的第8個月時，直接免疫熒光法分析免疫復(fù)合物在腎臟中沉積的情況，HE染色檢查腎臟病理損傷的狀況。
　　結(jié)果：
　　1.建模后第10天，小鼠脾臟中CD11b+細胞(Mφ)、CD11c+細胞(DC)、Gr1+(粒細胞)

16、以及CD21+細胞(B細胞)活化程度均出現(xiàn)上調(diào)，陽性率分別為7.35±0.60%3.78±0.26%、9.85±0.73%及20.94±1.24%，顯著高于正常對照組(p＜0.05)；CD21+B細胞表面 B7-2以及 MHCⅡ的表達率也出現(xiàn)升高，分別為48.31±2.24%和67.15±3.62%，與對照組差異顯著(p＜0.05)。
　　2.建模組部分小鼠3個月時血清中ANA和dsDNA出現(xiàn)陽性(陽性率：30%和10%)，其陽性

17、率和抗體滴度隨著時間的推移而逐漸增加；至8個月時，模型組ANA檢測結(jié)果均為陽性，dsDNA抗體的陽性率達89%。
　　3.Pristane注射4個月后，30%的小鼠開始檢測到蛋白尿的出現(xiàn)，尿蛋白含量在0.3～3g/L(+～++)之間，蛋白尿的陽性率和尿蛋白含量隨時間推移而逐漸增加，監(jiān)測至第8個月，全部的建模組小鼠蛋白尿陽性，尿蛋白含量在1～2g/L(++～++++)之間。
　　4.經(jīng)直接免疫熒光檢測，8個月時，建模組小鼠腎臟

18、中腎小球毛細血管、系膜區(qū)等處出現(xiàn)明顯的免疫復(fù)合物沉積；HE染色以及組織病理學檢查顯示，模型小鼠腎小球體積增大，腎小球內(nèi)及系膜區(qū)淋巴細胞侵潤，部分腎小球血管袢變性壞死，腎小球囊腔增大。
　　結(jié)論：建立了與人類狼瘡表現(xiàn)類似的Pristane誘導(dǎo)的C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型。
　　第五部分B7-2分子特異性抗體及RNAi重組慢病毒對小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機制研究
　　目的：運用B7-2單克隆抗體和小鼠B7-

19、2基因RNAi重組慢病毒抑制B7/CD28協(xié)同刺激信號，研究及比較不同方式對小鼠狼瘡樣腎炎模型的形成及病理損傷的免疫干預(yù)效應(yīng)并探究其分子機制。
　　方法：B7-2抗體早期干預(yù)組：在給予一次性腹腔注射0.5mL Pristane后，每只小鼠分別于第1、3、5、8、15天尾靜脈注射200μg B7-2單克隆抗體，隨后的3個月內(nèi)每隔1個月注射一次；延遲B7-2抗體干預(yù)組：在建模4個月后，直到小鼠出現(xiàn)蛋白尿以及自身抗體時給予B7-2抗體進

20、行干預(yù)，給藥方式及劑量與早期B7-2抗體干預(yù)組相同；重組小鼠B7-2基因RNAi慢病毒干預(yù)組：每只小鼠分別于第1天和第60天尾靜脈注射0.5×108 TU重組慢病毒LV-425；同時設(shè)立正常對照、同型抗體對照、化學藥物(環(huán)磷酰胺，CTX)對照及重組慢病毒LV-NC對照。Pristane注射10天后流式細胞術(shù)分析LV-425對小鼠脾臟APC表面B7-2分子表達的干擾效應(yīng)，同時檢測各組小鼠脾臟中巨噬細胞、樹突狀細胞、粒細胞以及B細胞的活化情

21、況；通過間接免疫熒光法和Albustix試紙法監(jiān)測小鼠血清自身抗體(ANA和抗dsDNA抗體)的表達水平及蛋白尿產(chǎn)生的情況；運用ELISA法檢測小鼠血清中IFN-γ及IL-4的含量，直接免疫熒光法分析小鼠腎臟中免疫復(fù)合物沉積的狀況，；直接免疫熒光法分析免疫復(fù)合物在小鼠腎臟中沉積的狀況，并通過光鏡及透射電鏡進行小鼠腎臟病理學檢查。
　　結(jié)果：
　　1.小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒給藥后，脾臟中Mφ(CD11b+)、DC(

22、CD11c+)及B細胞(CD21+)膜型B7-2表達率顯著低于建模組(p＜0.05)。
　　2.運用B7-2抗體和小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒LV-425早期干預(yù)后，小鼠脾臟APC的活化程度較建模組顯著降低(p＜0.05)。
　　3. B7-2單克隆抗體與重組慢病毒LV-425早期干預(yù)抑制了小鼠ANA及抗dsDNA抗體的表達：3個月時ANA及抗dsDNA抗體均呈陰性，各干預(yù)組與建模組相比ANA及抗dsDNA抗體8個月時

23、的陽性率和滴度均呈現(xiàn)顯著的下降，差異具有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)，且B7-2抗體早期干預(yù)組與重組慢病毒LV-425干預(yù)組及B7-2抗體延遲干預(yù)組之間也有顯著性差異(p＜0.05)。
　　4.第8個月時B7-2抗體干預(yù)組與LV-425干預(yù)組小鼠血清中IFN-γ及IL-4的含量與建模組相比均出現(xiàn)下降，差異具有顯著性(p＜0.05)。
　　5.B7-2抗體干預(yù)組及小鼠B7-2基因RNAi重組慢病毒干預(yù)組小鼠蛋白尿程度減輕：8個月

24、時，B7-2抗體早期干預(yù)及延遲干預(yù)組、重組慢病毒LV-425干預(yù)組小鼠的尿蛋白含量均顯著低于建模組，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；B7-2抗體早期干預(yù)組小鼠蛋白尿的程度以及陽性率低于LV-425干預(yù)組及B7-2抗體延遲干預(yù)組，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。
　　6.B7-2抗體早期干預(yù)LV-425干預(yù)及B7-2抗體延遲干預(yù)均使小鼠腎臟免疫復(fù)合物沉積不同程度減少，同時也減輕了小鼠腎小球炎癥損傷和壞死的程度，各組中B7-2