同步輻射圓二色光譜學研究生物大分子結(jié)構(gòu)與功能.pdf

1、本論文主要利用同步輻射真空紫外圓二色(SRCD)光譜學方法，結(jié)合動態(tài)光散射(DLS)、X射線晶體學以及原子力顯微鏡(AFM)等實驗方法研究了溶液條件下生物大分子的結(jié)構(gòu)與相變：(1)原發(fā)性痛風病人體內(nèi)磷酸核糖焦磷酸合成酶1(PRS1)及其點突變體的溶液構(gòu)象；(2)聚陰離子ATP對溶菌酶解折疊過程的影響；(3)絲素蛋白重鏈N端親水區(qū)(Fib-H N domain)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。在二級結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，分別探討了點突變導致PRS1超活性

2、的機理、ATP促進溶菌酶形成淀粉樣纖維的機制以及Fib-H N domain在自然紡絲過程中發(fā)揮的作用。
　　 1、點突變導致PRS1超活性的機理
　　 本工作表達純化了PRS1及D52H、N114S、L129I、D183H、A190V和H193Q六個致病點突變體，酶活性測試顯示點突變導致酶活性顯著升高。利用SRCD、DLS等方法研究了它們在結(jié)合底物、抑制物前后構(gòu)象與聚集狀態(tài)的變化。研究發(fā)現(xiàn)PRS1蛋白的活性形式并不依賴

3、于其聚集態(tài)，但是底物ATP能夠引起PRS1聚集成六聚體。抑制劑ADP結(jié)合位點位于六聚結(jié)合界面上，所以六聚的形成為ADP進行別構(gòu)抑制調(diào)控提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。這一復雜的酶活性調(diào)控機制使得酶催化活性處于正常水平。當PRS1發(fā)生點突變時，其聚集能力被顯著弱化，有的點突變甚至導致聚集消失(比如N114S和L129I)，這相應的弱化了ADP的別構(gòu)調(diào)控能力。而且SRCD研究發(fā)現(xiàn)點突變導致蛋白底物結(jié)合構(gòu)象改變，晶體結(jié)構(gòu)分析揭示N114S底物結(jié)合構(gòu)象的改變可

4、能會破壞PO43-別構(gòu)位點。所以點突變導致的底物結(jié)合構(gòu)象的改變也許是酶超活性的另一個原因。這些因素一起導致酶出現(xiàn)超活性，最終引發(fā)痛風。
　　 2、ATP促進溶菌酶形成淀粉樣纖維的機制
　　 利用AFM、SRCD、DSC等方法研究了聚陰離子ATP對溶菌酶溶液構(gòu)象、解折疊過程以及淀粉樣纖維形成的影響。研究發(fā)現(xiàn)ATP可以結(jié)合到溶菌酶上，而且ATP磷酸基團的強烈靜電效應使得溶菌酶上暴露的色氨酸殘基卷入更加疏水的環(huán)境，從而改變了蛋

5、白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。在升溫解折疊過程中，色氨酸殘基位置的改變降低了溶菌酶的熱穩(wěn)定性，導致了二級結(jié)構(gòu)的非協(xié)同性展開，在50℃左右產(chǎn)生了一個含有相對豐富螺旋和較少β-片結(jié)構(gòu)的部分展開中間體。DLS實驗說明部分展開中間體相比于天然結(jié)構(gòu)具有更強的聚集傾向。此外，ATP非特異性結(jié)合到伸展的多肽鏈上，屏蔽了相應的反應基團，抑制了溶菌酶展開過程的可逆性。因此ATP誘導的溶菌酶的不穩(wěn)定和非協(xié)同性展開，是ATP促進溶菌酶形成纖維狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)在基礎(chǔ)。同時也表明，

6、相比于單體的富β-片中間體，淀粉樣纖維片段的變性程度才是纖維形成的關(guān)鍵因素。
　　 3、Fib-H N domain(FN)的構(gòu)象轉(zhuǎn)變
　　 利用SRCD方法研究了四個不同長度的不含信號肽(1～21位殘基)區(qū)域的FN片段，即FN(22-71)、FN(22-104)、FN(22-126)和FN(22-145)，在不同溶液條件下發(fā)生的Coil-to-β構(gòu)象轉(zhuǎn)變，探討了FN在絲紡織過程中的功能。結(jié)合AFM等實驗手段，發(fā)現(xiàn)在能夠

7、形成β-片結(jié)構(gòu)的溶液條件下，這些FN片段能夠形成直徑為50-100 nm的納米球狀或者納米囊泡狀結(jié)構(gòu)，而且這些納米球狀結(jié)構(gòu)可以互相融合形成不規(guī)則的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。并且發(fā)現(xiàn)FN片段越長越容易發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變和形成納米球狀結(jié)構(gòu)。相比于絲素蛋白重鏈中大量的疏水重復區(qū)段，F(xiàn)ib-H N domain除了增加蛋白溶解度的功能外，可能扮演著一種感受器的角色，能夠迅速感知周圍環(huán)境改變的信號，從而引起整個絲素蛋白重鏈的構(gòu)象變化。這些納米球狀結(jié)構(gòu)的自組裝可能作為一