瓊膠酶的發(fā)酵條件優(yōu)化、表達(dá)調(diào)控和酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、瓊膠酶是一種能夠催化瓊膠水解的酶。根據(jù)瓊膠的裂解方式不同,瓊膠酶可以分成α-瓊膠酶(E.C.3.2.1.158)和β-瓊膠酶(E.C.3.2.1.81)兩類。瓊膠酶水解瓊膠產(chǎn)生的瓊膠低聚糖具有顯著的生物活性,因此瓊膠酶在食品、化妝品工業(yè)和醫(yī)藥領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。此外,瓊膠酶還被用作生理學(xué)、生物學(xué)以及細(xì)胞學(xué)研究的工具酶。
　　本文利用瓊膠為唯一碳源,從青島近海海域的海草樣品中篩選分離到6株海洋瓊膠降解細(xì)菌。對(duì)6株海洋菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)

2、,采用DNS法測(cè)得了它們的胞外瓊膠酶活性,克隆其16SrDNA序列進(jìn)行分子鑒定并測(cè)得了部分生理生化特征指標(biāo)。從鑒定結(jié)果來看,初步判斷6株菌分別屬于6種不同菌屬,其中OAG04的屬別未確定,還需進(jìn)一步的研究鑒定,OAG07與實(shí)驗(yàn)室保藏的一株海洋瓊膠降解菌Agarivorans gilvus WH0801屬于同一個(gè)屬。
　　Agarivorans gilvus WH0801是杜宗軍等從威海海岸的新鮮海藻樣本中篩選出的一株具有高效瓊膠降

3、解能力的菌株,對(duì)該菌株的發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶條件進(jìn)行了優(yōu)化并對(duì)該酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。首先初步確定酶活測(cè)定的最佳時(shí)間為48h。然后通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)及Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),對(duì)菌株Agarivorans gilvus WH0801發(fā)酵產(chǎn)瓊膠酶的條件進(jìn)行了優(yōu)化。Plackett-Burman設(shè)計(jì)表明瓊脂粉、酵母粉和種齡三個(gè)因素對(duì)瓊膠酶產(chǎn)量具有顯著影響。Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)確定此三個(gè)因素的最適水平為:瓊脂

4、粉2.50g/L、酵母粉0.88g/L、種齡25.64h。其它因素水平分別為蛋白胨1g/L、檸檬酸鐵0.01g/L、初始pH7.0、培養(yǎng)溫度28oC。經(jīng)優(yōu)化后,酶活最大值為1.158U/mL,比優(yōu)化前的酶活提高了約6.2倍,與已報(bào)道的瓊膠酶產(chǎn)生菌的酶活相比具有較大的優(yōu)勢(shì)。另外,我們還通過單因子實(shí)驗(yàn),確定了酶解反應(yīng)的最適溫度為45oC;最適底物濃度為1％;在pH7.0-8.0的范圍內(nèi),酶解反應(yīng)的最適pH為7.6。
　　工程菌株E.c