基于靜應力加載腦組織切片探討血腫應力誘導神經損傷初步過程.pdf

1、出血性腦卒中是致死和致殘率最高的腦血管病，且預后多有嚴重的神經功能障礙等后遺癥。過去針對腦出血的研究大多以單一神經元為靶點，考察其發(fā)生與發(fā)展過程中的生化損傷，如缺氧、興奮性氨基酸毒性、自由基損傷、紅細胞裂解代謝產物、炎癥反應等。除此之外，腦出血過程中還存在著瞬時血流沖擊應力、剪切應力以及血腫長期的占位擠壓應力（血腫應力）等。而這些不容忽視的應力在高血壓腦出血的發(fā)生與發(fā)展過程中是否發(fā)揮著重要作用，卻鮮有報道。因此本課題以腦組織切片（腦片）

2、為模型，重點探討了高血壓腦出血后，血腫應力對組織損傷的初步過程，并通過神經元培養(yǎng)實驗加以驗證?；谏锪W探討神經組織損傷機制，能為進一步認識出血性腦卒中發(fā)生發(fā)展的過程提供新的視角，能為該領域臨床干預和新藥研發(fā)提供新的思路。本文主要研究內容及結果如下：
　?、贅嫿ú⒃u價了腦片應力加載培養(yǎng)體系。本課題采用微孔濾膜培養(yǎng)法，利用Transwell細胞培養(yǎng)小室進行腦組織切片培養(yǎng)，并以密閉應力加載裝置對組織切片及細胞進行應力加載，構建了切片

3、及細胞應力加載培養(yǎng)體系。通過正置相差顯微鏡、乳酸脫氫酶酶標以及促凋亡基因 BAX定量 PCR等手段，對切片最佳培養(yǎng)條件、活性窗口期進行考察。結果表明，切片最佳活性窗口期為2~6天，最佳換液時間間隔為24h，損傷應力加載大小為40kPa。
　?、谔接懥遂o壓力對腦片損傷的初步過程。1）通過對神經元特異性標志物神經元烯醇化酶（NSE）、神經膠質細胞特異性標志物膠質細胞酸性蛋白（GFAP）以及神經元骨架結構蛋白β-III的免疫熒光染色，發(fā)

4、現(xiàn)在應力加載后，神經元及膠質細胞活性減弱；2）采用熒光定量PCR技術分別對PIEZO家族、TRPV4等陽離子通道基因的信使RNA（mRN A）在應力加載前后進行定量檢測。結果表明，應力加載后，mRN A含量迅速上升，撤去應力培養(yǎng)一段時間后mRN A含量再次顯著上升；3）通過westernblot技術分別測定了應力加載前后PIEZO家族、TRPV4蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)其蛋白表達量在應力加載后迅速升高。與基因檢測的結果不同，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，

5、其表達量并沒有繼續(xù)升高，反而呈現(xiàn)下降的趨勢；4）PIEZO家族蛋白以及TRP V4陽離子通道蛋白表達的上調，會使細胞內外陽離子濃度發(fā)生變。鈣離子熒光探針結果表明，應力加載后，Ca2+內流，細胞內Ca2+濃度升高。過高的胞內Ga2+濃度將會激活促凋亡基因的表達；5）最后通過熒光定量PCR技術，對應力加載后促凋亡基因BAX以及抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA含量進行檢測，以表征切片活性。結果顯示，應力加載后，BAX基因mRNA含量迅速上升，

6、Bcl-2基因急劇下降，并在撤去應力后仍然保持此趨勢，表明切片活性隨著在應力加載后急劇下降，與免疫熒光實驗結果一致。
　?、凵窠浽毎麘虞d，進一步補充和驗證了基于腦片應力加載的損傷途徑。實驗表明，應力加載后，培養(yǎng)體系中LDH濃度立即升高，而切片培養(yǎng)體系中LDH濃度先降低，再升高；TRPV4、PIEZO家族離子通道蛋白表達量迅速上升，撤去應力后，其表達量立即下降。其次，靜壓力的加載，直接或間接的影響了骨架微管蛋白β-III的表達