RNA解旋酶Rig-I對巨噬細胞的影響及作用機制研究.pdf

1、第一部分Rig-I對巨噬細胞的數量及凋亡的影響
　　摘要RIG-I（retinoic acid-inducible gene-I）最初是在全反式維甲酸（all trans-retinoic acid，ATRA）誘導急性早幼粒細胞白血病（acute promyelocytic leukemia，APL）細胞系NB4分化過程中被發(fā)現(xiàn)顯著上調的基因。目前普遍認為，Rig-I是細胞質內病原模式識別受體的一種，通過特異性識別外源RNA在宿主

2、抗病毒先天免疫功能中發(fā)揮重要作用。在病毒感染情況下，Rig-I通過其RD結構域識別相應病毒RNA，與下游信號分子IPS-1（Interferon-beta promoter stimulator1，MAVS/Cafrdif/VISA）發(fā)生相互作用，從而激活下游的IRF3（IFN regulatory factor3）和NF-κB信號通路，產生I型干擾素和炎癥因子，抵抗病毒入侵。但在我們以往的研究中，意外發(fā)現(xiàn)Rig-I基因缺失小鼠的抗細菌

3、免疫能力低下，易發(fā)生條件性致病菌感染。Rig-I基因剔除純合子小鼠由于B細胞分化缺陷和免疫球蛋白轉換受阻導致眼部及頸部皮膚易發(fā)生條件性致病菌-木糖型葡萄球菌（S.xylosus）感染。另外Rig-I基因剔除小鼠容易發(fā)生結腸炎、T細胞活化缺陷和粒細胞的過度增殖。這說明Rig-I在抗病毒以外，在細菌免疫反應中也發(fā)揮重要作用。另外細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)Rig-I可以通過調節(jié)GTP酶家族Rac/Cdc42的活性來影響細胞骨架蛋白actin的重組，從而促進

4、巨噬細胞對細菌的吞噬能力，Rig-I基因剔除小鼠對E.coli的吞噬能力減弱。巨噬細胞是天然免疫免疫系統(tǒng)防御體系的重要一員。我們利用現(xiàn)有的Rig-I基因剔除小鼠模型，采用流式細胞術的方法，對小鼠的腹腔巨噬細胞總數和凋亡以及大巨噬細胞（Large peritioneal macrophages，LPM）和小巨噬細胞（Small peritoneal macrophages，SPM）的數量進行分析。與野生型小鼠相比，Rig-I基因敲除小鼠腹

5、腔巨噬細胞的總數明顯減少、凋亡增加以及腹腔巨噬細胞LPM和SPM的數量上都發(fā)生顯著減少。這說明Rig-I對小鼠的腹腔巨噬細胞的數量起著重要調節(jié)作用，這可能與Rig-I基因敲除的小鼠易發(fā)生條件致病菌感染存在某種的聯(lián)系。
　　第二部分Rig-I對LPS誘導的巨噬細胞增殖、凋亡及功能的作用研究
　　摘要位于革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）是巨噬細胞的潛在激活劑。LPS通過激活TLR4啟

6、動天然免疫反應。本研究我們以LPS誘導巨噬細胞為模型，探討Rig-I基因對LPS誘導巨噬細胞增殖、凋亡和細胞因子分泌等生物學功能的影響及其作用機制。以不同劑量的LPS刺激Rig-I基因沉默和過表達的小鼠巨噬細胞系Raw264.7細胞，采用CCK8和流式細胞術檢測細胞的生長狀態(tài)；采用qPCR方法檢測細胞因子TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6相關基因的表達水平；利用transwell檢測巨噬細胞的遷移；對巨噬細胞與細胞外基質的粘附作

7、用進行分析；采用Western blot方法檢測LPS誘導的TLR4信號通路的相關蛋白表達水平。CCK8和流式細胞術結果顯示Rig-I促進巨噬細胞的增殖并抑制LPS誘導的細胞凋亡，qPCR結果表明Rig-I促進巨噬細胞中TNF-α、IL-10、IL-1和IL-6基因的表達。進一步實驗證實Rig-I通過激活AKT及其下游蛋白p-38、NF-κB和Bcl-xL等抑制細胞凋亡并促進細胞因子的表達。因此，本研究首次證實了Rig-I可通過AKT信