基于多反應監(jiān)測方法評估中藥對肝微粒體CYP450的調(diào)控作用研究.pdf

1、目的：臨床用藥過程中，大部分藥物進入體內(nèi)主要通過肝臟的藥物代謝酶進行代謝，不同的藥物對藥物代謝酶細胞色素P450酶（Cytochromes p450，CYP450）具有不同的影響作用，針對中藥藥物代謝酶傳統(tǒng)定量研究方法具體主要有以下三個方面：1）基于免疫印跡法的蛋白豐度定量；2）基于實時定量聚合酶鏈反應的mRNA豐度檢測；3)基于探針藥物法的酶活性測定。CYP450家族蛋白豐度較低，同源性高，免疫印跡法無法對同源性高，缺乏針對特異抗原決

2、定簇抗體的CYP450亞型進行定量，例如CYP3A4和CYP3A5，CYP1A2和CYP1A1等；mRNA水平無法正確評估相應蛋白水平，兩種實驗方法分別存在特異性不強和準確度不高，重現(xiàn)性不好等缺點，基于探針藥物法的酶活性測定方法只針對幾種主要的CYP450進行研究,罕見的CYP450亞型極少有相關報道，因此需要建立新的特異性更強的高通量CYP450豐度測定方法，探究CYP450亞型參與的中藥代謝過程以及中藥對CYP450豐度的調(diào)控作用，

3、以及中藥藥物配伍使用時由于CYP450的變化引起藥物相互作用。獲取藥物對CYP450亞型的調(diào)控信息可避免因CYP450的變化所引起的藥物失效以及副反應。選取幾種常見的傳統(tǒng)中藥進行CYP450研究具有較好臨床意義。
　　方法：本研究基于多反應監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）結合定量串聯(lián)體（Quantification concatamers，QconCAT）技術對肝微粒體酶CYP450亞型進行

4、定量，MRM是一種可對靶向肽段離子進行篩選、監(jiān)測，進而對肽段進行定量的質譜方法，通過定量串聯(lián)體法獲取得到純度極高的重型同位素肽段作為內(nèi)標，與正常的樣品相應肽段在同一個色譜保留時間出峰，根據(jù)兩者的差異，對目的蛋白樣品豐度進行定量。本實驗將MRM結合QconCAT技術應用于對中藥（丹參、白芍、附子、參附、人參）處理后大鼠肝臟微粒體CYP450豐度進行定量，研究五味藥物分別對CYP450亞型的調(diào)控作用，同時將該方法進一步運用到對細胞內(nèi)的CYP

5、3A4定量研究中，證實利福平對CYP3A4豐度的誘導作用。
　　結果：1）方法學評估：選用多濃度質控樣本進行方法學研究，定量方法精密度在3.85％以內(nèi)，相對誤差在4%以內(nèi)，線性系數(shù)大于0.9。成功對11種大鼠肝微粒體CYP450亞型蛋白的21條肽段進行絕對定量；2）正常大鼠肝臟微粒體中CYP450酶亞型CYP1A1，CYP1A2，CYP2B1， CYP2B2，CYP2C6，CYP2C11， CYP2D1，CYP3A1，CYP3A2

6、，CYP17A1和CYP2E1蛋白平均豐度分別為15.12，14.43，5.63，2.37，6.05，18.27，16.24，4.78，48.2，69.32，66.66fmol/μg微粒體。五味中藥（丹參、白芍、附子、參附、人參）作用后大鼠肝藥酶CYP450豐度進行定量，并與對照組相比，丹參對CYP1A1，CYP2B2具有抑制作用，對CYP1A2， CYP2B1具有誘導作用。人參抑制CYP3A2，CYP2C11和CYP17A1的表達，白

7、芍對CYP1A1，CYP2C6，CYP2C11，CYP3A2產(chǎn)生抑制作用，對CYP1A2，CYP2D1產(chǎn)生誘導作用，附子對CYP1A1，CYP2D1起誘導作用，而對其他大部分CYP亞型CYP2C6，CYP2C11，CYP3A2，CYP17A1都有抑制作用。參附抑制CYP1A1， CYP2C6，CYP2C11，CYP2E1，CYP3A2蛋白的表達，僅誘導CYP1A2和CYP3A1等規(guī)律；3）將該方法進一步用于對原代肝細胞主要肝藥酶CYP3