草魚腦芳香化酶的cDNA克隆、啟動(dòng)子分離與轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控.pdf

1、細(xì)胞色素P450芳香化酶能夠催化雄性激素向雌性激素的轉(zhuǎn)化，被認(rèn)為是類固醇激素代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。在硬骨魚中存在兩種芳香化酶異構(gòu)體，P450aromA和P450aromB，分別在性腺組織和腦組織中有高表達(dá)。有趣的是，硬骨魚的腦芳香化酶活性大約是其他脊椎動(dòng)物的100-1000倍，但至今對(duì)這種現(xiàn)象未有合理的解釋。在目前的研究中，我們運(yùn)用RT-PCR以及快速擴(kuò)增cDNA末端(RACE)的方法成功克隆了草魚腦芳香化酶(gcP450aromB)

2、的cDNA序列。該序列全長(zhǎng)共有1947bp，其中開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)1527bp，可以編碼509個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，草魚腦芳香化酶與其他硬骨魚類腦芳香化酶有較高的相似性(66％-93％)，而與性腺芳香化酶僅有約60％相似性，與哺乳動(dòng)物芳香化酶有50％的相似性。運(yùn)用半定量RT-PCR的方法進(jìn)行組織分布研究發(fā)現(xiàn)，在所選擇的10個(gè)組織中，僅在腦和垂體腺中發(fā)現(xiàn)了gcP450aromaB的mRNA表達(dá)，進(jìn)一步在腦的不同區(qū)域中發(fā)現(xiàn)

3、gcP450aromB的mRNA在視前區(qū)、下丘腦和垂體區(qū)域有表達(dá)。此外，利用基于PCR方法的基因步移法克隆了草魚腦芳香化酶基因5’端的上游序列。所獲得的啟動(dòng)子序列共有2.3kb，其中包括了1個(gè)TATA框，1個(gè)CAAT框以及許多潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括GATAs，AP1，ERE，CRE，C/EBP，NF-1, Sp1, PPARalpha/RXR-alpha, SREBP-1, GP, NF-kappaB, AhR/Arnt, STA

4、Tx元件和CRE-BP1/c-Jun等等。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，gcP450aromB基因的翻譯從第二個(gè)外顯子開(kāi)始，與不翻譯的第一個(gè)外顯子之間存在一個(gè)較長(zhǎng)的內(nèi)含子，大約有2.7kb。草魚腦芳香化酶啟動(dòng)子活性的檢測(cè)是以體外大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞(C6)為模型，對(duì)5’端上游序列采取5’端逐漸缺失片段構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)質(zhì)粒來(lái)完成。結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照pGL-3-basic相比，幾乎所有包括了第一個(gè)內(nèi)含子全部序列的報(bào)告質(zhì)粒都表現(xiàn)出不同程度的轉(zhuǎn)

5、錄活性，而僅含有啟動(dòng)子序列的的報(bào)告質(zhì)粒都沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性。實(shí)驗(yàn)中還初步探討了下丘腦分泌因子(PACAP)和垂體分泌激素(STH、GTH和activin)對(duì)調(diào)控序列轉(zhuǎn)錄活性的影響，表明PACAP在調(diào)控序列缺失到pGL3-159/+2822后一直表現(xiàn)為明顯的抑制作用，而GTH對(duì)不同長(zhǎng)短的啟動(dòng)子序列的轉(zhuǎn)錄水平都呈現(xiàn)出抑制作用，特別是在pGL3+1855/+2822抑制效果尤為顯著。與之不同的是，生長(zhǎng)激素(STH)在報(bào)告質(zhì)粒pGL3-828/+28