miR-29c通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子1抑制人血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成的研究.pdf

1、第一部分 miR-29c對(duì)血管形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響
　　目的:探討miR-29c對(duì)血管形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響。
　　方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），并構(gòu)建miR-29C mimics和miR-29C inhibitor轉(zhuǎn)染。通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)miRNA轉(zhuǎn)染后相關(guān)因子mRNA的表達(dá)，Western Blot檢測(cè)miRNA轉(zhuǎn)染后相關(guān)因子蛋白的表達(dá)，免疫熒光檢測(cè)VEGF表達(dá)。
　　結(jié)果：

2、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物造成PI3K，AKT和VEGF mRNA和蛋白表達(dá)水平的顯著下降(P<0.01)，但I(xiàn)GF-1僅表現(xiàn)為蛋白水平下降，mRNA表達(dá)卻無(wú)明顯改變(P>0.05)。免疫熒光細(xì)胞組化檢測(cè)結(jié)果顯示，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-29c模擬物能明顯抑制VEGF表達(dá)(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染 miR-29c抑制劑組 VEGF表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)。
　　結(jié)論：miR-29c能夠抑制血管形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子 P

3、I3K、AKT和VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)。同時(shí)，miR-29c能下調(diào)IGF-1的蛋白表達(dá)，但不影響其mRNA表達(dá)，提示其對(duì)IGF-1的作用為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，即翻譯抑制。
　　第二部分 miR-29c對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管形成能力的影響
　　目的:探討miR-29c對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖活性、遷移能力及血管形成能力的影響。
　　方法：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）培養(yǎng)并轉(zhuǎn)染。通過(guò) MTT、EdU檢測(cè)轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)

4、胞增殖能力影響，流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期變化，Transwell檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力變化，小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的血管形成能力變化。
　　結(jié)果：在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物組，HUVECs和293-T細(xì)胞的增殖率分別下降了57.6％和36.3%，與空白組對(duì)照有顯著性差異（P<0.05）；轉(zhuǎn)染miR-29c模擬物組與其余組比較，DNA合成S期的細(xì)胞數(shù)量最少，進(jìn)入G2期的細(xì)胞數(shù)量最多，HUVECs增殖活性明顯下降，HUVE

5、Cs遷徙能力明顯減弱，較空白對(duì)照組下降了31%，較轉(zhuǎn)染 miR-29c抑制劑組下降64%；細(xì)胞血管生成能力顯著下降，生成血管的直徑較小且成環(huán)率降低（P<0.05）。轉(zhuǎn)染miR-29c抑制劑組與其余組比較，DNA合成S期的細(xì)胞數(shù)量最多，HUVECs增殖活性明顯增強(qiáng)，HUVECs遷徙能力明顯增強(qiáng)，細(xì)胞血管生成能力也有加強(qiáng)（P<0.05）。
　　結(jié)論：miR-29c能抑制HUVECs的增殖活性、細(xì)胞移行及血管形成，這可能由于 miR-2

6、9c的表達(dá)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的信號(hào)通路有影響，進(jìn)而影響了細(xì)胞的生物學(xué)行為。
　　第三部分 miR-29c抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的分子機(jī)制研究
　　目的:探討miR-29c抑制血管形成能力的機(jī)制。
　　方法：培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）后進(jìn)行miRNA靶向基因的生物學(xué)預(yù)測(cè)。通過(guò)構(gòu)建IGF-13’UTR端熒光素酶質(zhì)粒后進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)研究 miR-29c抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的分子

7、機(jī)制。
　　結(jié)果：miR-29c模擬物能明顯降低IGF-13′UTR螢光素酶報(bào)告基因的熒光強(qiáng)度（P<0.05）；但是卻不能降低IGF-13′UTR突變組螢光素酶報(bào)告基因的熒光強(qiáng)度（P>0.05）。當(dāng)加入miR-29c抑制物后，IGF-13′UTR螢光素酶報(bào)告基因的熒光強(qiáng)度明顯增加（P<0.05），但突變較對(duì)照組沒(méi)有明顯變化（P>0.05）。細(xì)胞劃痕24h后，轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（ HUVECs）組

8、劃痕愈合的速度明顯弱于轉(zhuǎn)染miRNA-29c inhibitor的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）（P<0.01，圖3.3、3.4）；當(dāng)轉(zhuǎn)染miRNA-29c mimics的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）加入IGF-1后，劃痕愈合的速度明顯增加（P<0.05），提示IGF-1拯救了miRNA-29c導(dǎo)致的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）遷徙能力降低的現(xiàn)象。
　　結(jié)論：IGF-1/PI3K/AKT/VEGF途徑可以調(diào)節(jié)血管的生成，