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文檔簡介
1、骨性關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以關節(jié)軟骨進行性損害為主要特征的慢性關節(jié)疾病。OA的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明,但肥胖是OA危險因素之一。肥胖患者體重增加不僅通過增加膝關節(jié)負荷導致膝關節(jié)OA,同時改變膝關節(jié)生物學機制,從而進一步導致OA發(fā)發(fā)展。在研究肥胖參與OA的發(fā)病機制時,利用高脂飲食誘導小鼠發(fā)生OA,可能是研究肥胖與OA關系的有效方法。
OA為退行性病變,其發(fā)生發(fā)展過程為不可逆,所以能夠早期發(fā)現和預防OA
2、發(fā)生尤為重要。白藜蘆醇(resveratrol,RES)作為一種天然的多酚類化合物,具有抗氧化、抗炎性、抗衰老、抗凋亡和調節(jié)糖脂代謝等多種作用。許多體外及體內研究結果均表明RES可以拮抗OA的發(fā)生發(fā)展,但其作用機制并未完全闡明。
目的:
本研究擬利用高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠發(fā)生肥胖的方法建立OA動物模型,通過血清學、病理學、軟骨細胞凋亡來判定OA的發(fā)生情況;同時進行不同劑量RES干預,觀察RES對OA的干預效
3、果,為探討OA與肥胖的關系及OA的營養(yǎng)防治措施提供實驗依據。
方法:
一、動物的分組
將60只C57BL/6J雄性小鼠,適應性喂養(yǎng)一周后按體重隨機分為對照組、高脂組、RES低劑量干預組(低劑量組)、RES中劑量干預組(中劑量組)及RES高劑量干預組(高劑量組),每組12只,對照組喂食基礎飼料,高脂組和干預組喂食高脂飼料。
二、動物處理及樣品采集
對照組和高脂組給予0.5%羧甲基纖維素鈉(
4、CMC)水溶液灌胃。干預各組給予0.5%CMC與RES懸濁液灌胃,其中低劑量組RES干預劑量為5mg/kg/d;中劑量組RES干預劑量為22.5mg/kg/d;高劑量組RES干預劑量為45mg/kg/d。各組小鼠均自由進食和飲水,每周稱重,共計12周。
實驗結束后收集小鼠血清,-80℃保存?zhèn)溆谩H⌒∈笞笙轮リP節(jié),固定、脫鈣后進行石蠟包埋,切5μm組織切片備用。
三、檢測指標
?。ㄒ唬w重
?。ǘ┭?/p>
5、清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平采用酶偶聯(lián)比色法檢測。
(三)血清Ⅱ型膠原C端肽(CTX-Ⅱ)水平采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測。
?。ㄋ模┸浌墙M織形態(tài)學觀察
對各個組織切片行HE染色、番紅O染色和番紅O-固綠染色,并利用雙盲法對其進行Mankin評分。
?。ㄎ澹┸浌墙M織Ⅱ型膠原蛋白表達
利用免疫組化方法,檢測各組小鼠膝關節(jié)軟骨組織Ⅱ型膠原蛋白的表達,并利用ImageJ2x軟件
6、進行平均灰度值測量。
?。┸浌墙M織細胞凋亡情況
利用TUNEL法檢檢測軟骨組織細胞凋亡情況,計數各組織切片凋亡細胞數。
四、數據處理和統(tǒng)計分析
用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析,結果用(x)± SE表示,方差分析方法進行組間比較。檢驗水準為α=0.05。
結果:
一、小鼠體重變化狀況
實驗期間,各組小鼠一般狀況良好,生長發(fā)育未見異常。高脂組小鼠體重高于對照組,
7、差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);各干預組小鼠體重低于高脂組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
二、小鼠血清TG、TC水平
高脂組血清TG水平均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01);中劑量組血清TG水平低于高脂組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);高脂組血清TC水平均高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。
三、小鼠血清CTX-Ⅱ水平
高脂組血清CTX-Ⅱ含量高于對照組,
8、差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05);各干預組中,高劑量組血清CTX-Ⅱ含量低于高脂組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
四、小鼠軟骨組織形態(tài)學評價
HE染色下觀察,對照組軟骨細胞排列整齊,軟骨組織表面平整,軟骨組織基質染色正常。高脂組軟骨細胞或減少或局部增加,且排列較為混亂,基質染色不均勻。各干預組軟骨細胞偶有增生或減少,排列不規(guī)則,各干預組間比較無明顯差異。
對照組軟骨組織在番紅O染色下潮線界線較為清
9、晰、完整,無缺失現象。高脂組軟骨組織可見潮線缺失,顏色變淺等現象。干預各組偶見潮線缺失,各干預組間比較無明顯差異。
番紅O-固綠染色顯示對照組軟骨組織較為完整及寬厚,軟骨與骨之間分界較清。高脂組可見軟骨組織出現破損情況,有些組織也較為扁薄。各干預軟骨與骨之間界線清楚,偶有軟骨組織缺失,各干預組之間比較沒有明顯差異。
Mankin評分及發(fā)病率結果顯示高脂組均最高,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干預組M
10、ankin評分及發(fā)病率與高脂組比較有不同程度下降,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
五、小鼠軟骨組織Ⅱ型膠原免疫組化染色結果
對照組軟骨細胞染色較深,基質與細胞分界清晰。高脂組軟骨細胞明顯減少,染色較淺,基質和細胞分界不清。各干預組軟骨細胞染色較為清晰。與對照組比較,高脂組平均灰度值較低,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。干預各組與高脂組比較,平均灰度值均有不同程度升高,但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
11、 六、小鼠關節(jié)軟骨組織細胞凋亡情況
高脂組與對照組比較,軟骨組織中的黃綠色顆粒多于對照組,在軟骨組織各個分層中都有分布。高脂組細胞凋亡率高于對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各干預組與高脂組比較,軟骨組織中的黃綠色顆粒有不同程度減少,其中以中劑量最為明顯,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
結論:
1.利用高脂飲食可以誘導C57BL/6J小鼠發(fā)生OA。
2.RES可以抑制高脂飲食誘導的
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