白藜蘆醇對高脂飲食誘導的C57BL-6J小鼠骨性關節(jié)炎模型干預效果研究.pdf

1、骨性關節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是以關節(jié)軟骨進行性損害為主要特征的慢性關節(jié)疾病。OA的病因和發(fā)病機制尚未完全闡明，但肥胖是OA危險因素之一。肥胖患者體重增加不僅通過增加膝關節(jié)負荷導致膝關節(jié)OA，同時改變膝關節(jié)生物學機制，從而進一步導致OA發(fā)發(fā)展。在研究肥胖參與OA的發(fā)病機制時，利用高脂飲食誘導小鼠發(fā)生OA，可能是研究肥胖與OA關系的有效方法。
　　OA為退行性病變，其發(fā)生發(fā)展過程為不可逆，所以能夠早期發(fā)現和預防OA

2、發(fā)生尤為重要。白藜蘆醇（resveratrol，RES）作為一種天然的多酚類化合物，具有抗氧化、抗炎性、抗衰老、抗凋亡和調節(jié)糖脂代謝等多種作用。許多體外及體內研究結果均表明RES可以拮抗OA的發(fā)生發(fā)展，但其作用機制并未完全闡明。
　　目的：
　　本研究擬利用高脂飲食誘導C57BL/6J小鼠發(fā)生肥胖的方法建立OA動物模型，通過血清學、病理學、軟骨細胞凋亡來判定OA的發(fā)生情況;同時進行不同劑量RES干預，觀察RES對OA的干預效

3、果，為探討OA與肥胖的關系及OA的營養(yǎng)防治措施提供實驗依據。
　　方法：
　　一、動物的分組
　　將60只C57BL/6J雄性小鼠，適應性喂養(yǎng)一周后按體重隨機分為對照組、高脂組、RES低劑量干預組（低劑量組）、RES中劑量干預組（中劑量組）及RES高劑量干預組（高劑量組），每組12只，對照組喂食基礎飼料，高脂組和干預組喂食高脂飼料。
　　二、動物處理及樣品采集
　　對照組和高脂組給予0.5％羧甲基纖維素鈉(

4、CMC)水溶液灌胃。干預各組給予0.5％CMC與RES懸濁液灌胃，其中低劑量組RES干預劑量為5mg/kg/d;中劑量組RES干預劑量為22.5mg/kg/d;高劑量組RES干預劑量為45mg/kg/d。各組小鼠均自由進食和飲水，每周稱重，共計12周。
　　實驗結束后收集小鼠血清，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ⌒∈笞笙轮リP節(jié)，固定、脫鈣后進行石蠟包埋，切5μm組織切片備用。
　　三、檢測指標
　?。ㄒ唬w重
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5、清甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)水平采用酶偶聯(lián)比色法檢測。
　　（三）血清Ⅱ型膠原C端肽(CTX-Ⅱ)水平采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測。
　?。ㄋ模┸浌墙M織形態(tài)學觀察
　　對各個組織切片行HE染色、番紅O染色和番紅O-固綠染色，并利用雙盲法對其進行Mankin評分。
　?。ㄎ澹┸浌墙M織Ⅱ型膠原蛋白表達
　　利用免疫組化方法，檢測各組小鼠膝關節(jié)軟骨組織Ⅱ型膠原蛋白的表達，并利用ImageJ2x軟件

6、進行平均灰度值測量。
　?。┸浌墙M織細胞凋亡情況
　　利用TUNEL法檢檢測軟骨組織細胞凋亡情況，計數各組織切片凋亡細胞數。
　　四、數據處理和統(tǒng)計分析
　　用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，結果用(x)± SE表示，方差分析方法進行組間比較。檢驗水準為α=0.05。
　　結果：
　　一、小鼠體重變化狀況
　　實驗期間，各組小鼠一般狀況良好，生長發(fā)育未見異常。高脂組小鼠體重高于對照組，

7、差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;各干預組小鼠體重低于高脂組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　二、小鼠血清TG、TC水平
　　高脂組血清TG水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);中劑量組血清TG水平低于高脂組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);高脂組血清TC水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。
　　三、小鼠血清CTX-Ⅱ水平
　　高脂組血清CTX-Ⅱ含量高于對照組，

8、差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);各干預組中，高劑量組血清CTX-Ⅱ含量低于高脂組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　四、小鼠軟骨組織形態(tài)學評價
　　HE染色下觀察，對照組軟骨細胞排列整齊，軟骨組織表面平整，軟骨組織基質染色正常。高脂組軟骨細胞或減少或局部增加，且排列較為混亂，基質染色不均勻。各干預組軟骨細胞偶有增生或減少，排列不規(guī)則，各干預組間比較無明顯差異。
　　對照組軟骨組織在番紅O染色下潮線界線較為清

9、晰、完整，無缺失現象。高脂組軟骨組織可見潮線缺失，顏色變淺等現象。干預各組偶見潮線缺失，各干預組間比較無明顯差異。
　　番紅O-固綠染色顯示對照組軟骨組織較為完整及寬厚，軟骨與骨之間分界較清。高脂組可見軟骨組織出現破損情況，有些組織也較為扁薄。各干預軟骨與骨之間界線清楚，偶有軟骨組織缺失，各干預組之間比較沒有明顯差異。
　　Mankin評分及發(fā)病率結果顯示高脂組均最高，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。干預組M

10、ankin評分及發(fā)病率與高脂組比較有不同程度下降，但無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　五、小鼠軟骨組織Ⅱ型膠原免疫組化染色結果
　　對照組軟骨細胞染色較深，基質與細胞分界清晰。高脂組軟骨細胞明顯減少，染色較淺，基質和細胞分界不清。各干預組軟骨細胞染色較為清晰。與對照組比較，高脂組平均灰度值較低，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。干預各組與高脂組比較，平均灰度值均有不同程度升高，但無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　

11、　六、小鼠關節(jié)軟骨組織細胞凋亡情況
　　高脂組與對照組比較，軟骨組織中的黃綠色顆粒多于對照組，在軟骨組織各個分層中都有分布。高脂組細胞凋亡率高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。各干預組與高脂組比較，軟骨組織中的黃綠色顆粒有不同程度減少，其中以中劑量最為明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論：
　　1.利用高脂飲食可以誘導C57BL/6J小鼠發(fā)生OA。
　　2.RES可以抑制高脂飲食誘導的