棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因克隆和在畢赤酵母中的表達.pdf

1、木霉菌（Trichoderma spp.）是一種應用前景廣闊的植物病害生物防治菌，含有很多優(yōu)良的生物防治基因，棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶基因就是其中之一。天冬氨酸蛋白酶（aspartic proteinase）是一類重要的蛋白水解酶，參與機體的新陳代謝及生物調控作用。它的活性中心由兩個催化性天冬氨酸殘基組成。能夠降解抗原，促進其他酶的活化，位點特異性水解逆轉錄酶病毒前體蛋白以產生病毒體復制所必須的酶蛋白等等。天冬氨酸蛋白酶廣泛存在于病毒、真

2、菌、哺乳動物及植物中，參與多種生理過程。天冬氨酸蛋白酶在生物防治等方面具有巨大的應用潛力。
　　為了利用重組天冬氨酸蛋白酶生產廣譜抗性的生物農藥，本研究采用易于培養(yǎng)、外源蛋白表達量高的畢赤酵母（Pichia pastoris）作為表達生產工具，從已構建好的質粒 p1762-mAsp中通過設計的引物擴增出棘孢木霉的mAsp基因，將經EcoR I和Not I雙酶切的mAsp基因和酵母表達載體pPIC9K進行體外連接，構建酵母重組表達載

3、體，經過菌液PCR檢測，雙酶切檢測并測序，得到有正確閱讀框的重組表達質粒pPIC9K-mAsp。
　　將pPIC9K-mAsp和pPIC9K空質粒分別用限制性內切酶Sac I線性化后，采用電轉化的方法轉化 GS115酵母感受態(tài)細胞，經過甲醇利用表型的篩選和PCR檢測篩選得到2株高效利用甲醇和1株低效利用甲醇的GS115型陽性轉化子。通過檢測各轉化子發(fā)酵液上清每隔24h的蛋白表達情況和酶活情況篩選出高效表達天冬氨酸蛋白酶的工程菌株G

4、a-2和Ga-5。
　　對兩株工程菌株分泌的重組mAsp粗酶液進行了酶活測定與酶學特性研究，同時對于重組mAsp的抑菌性進行了初步摸索。發(fā)現(xiàn)轉化子 Ga-2和Ga-5的產酶高峰出現(xiàn)在3d左右。確定酶系統(tǒng)發(fā)揮活性的最佳組合，即溫度40℃，pH值4.0，依照該體系以酪氨酸為底物測得的重組蛋白酶發(fā)酵液酶活能達到31.6μ/g。
　　重組天冬氨酸蛋白酶粗酶液對稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）的生長具有一定抑制作用，從

5、而證明了重組蛋白酶具有一定的抑菌能力。用觀察菌絲團大小的方法進行重組天冬氨酸蛋白酶粗酶液對病原菌抑菌實驗，結果顯示其對稻瘟病菌菌絲團的生長具有一定抑制作用，為今后的抑菌研究提供了新的方法，也為生物農藥酶制劑研究打下基礎。
　　棘孢木霉天冬氨酸蛋白酶能在畢赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表達產物同樣具有抑制真菌生長的優(yōu)良特性，這就預示了表達天冬氨酸蛋白酶在工業(yè)和生物學領域的廣闊應用前景。因此，期望能對該基因進行改造，尋找合適