雞Mx基因的克隆、表達及其抗病活性的研究.pdf

1、Mx基因是Lindenmann在研究A2G小鼠抗流感病毒試驗時發(fā)現(xiàn)的，因能抵抗粘液病毒而命名為Mx(myxovirus resistant)基因。關于禽類Mx蛋白的研究，1992年首次發(fā)現(xiàn)了鴨的Mx蛋白后，雞的Mx蛋白基因也被克隆，雞的Mx蛋白的抗病毒活性受631位氨基酸的影響，當631位氨基酸為天冬酰胺時有抗病毒活性，為絲氨酸時則無抗病毒活性。但將雞Mx蛋白用于提高雞體免疫力的研究還鮮見報道，本研究擬探索通過對同種異體雞Mx基因進行改

2、造構(gòu)建雞抗病毒重組基因、表達抗病毒蛋白的思路，旨意在從提高雞自身抗病毒能力上應對禽類病毒病的威脅探索新思路。主要研究如下： 1.以50μg/mL Poly(I)·Poly(C)誘導雞成纖維細胞Mx基因的表達，7小時后提取細胞總RNA，根據(jù)發(fā)表文獻設計一對擴增全長Mx cDNA特異性引物，采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出全長Mx cDNA，擴增產(chǎn)物克隆入pMDl9-TSimple載體中進行序列測定。結(jié)果：與GenBa

3、nk發(fā)表的雞Mx cDNA序列AB088535、AY695797、NM_204609、XM_429240、Z23168的同源性分別為99.6％、99.5％、99.4％、99.7％、99.4％，說明所擴增的序列為本實驗所要的。獲得的雞Mx cDNA序列在2032位堿基為G，該基因的抗病毒活性還需做進一步研究。 2.采用簡單易行的大引物PCR突變技術(shù)將雞Mx基因的全長eDNA第2032位的堿基由G突變?yōu)锳(既631位氨基酸的改變)，

4、并將突變的Mx基因插入真核表達載體pcDNA3.O，重組表達載體經(jīng)PCR、酶切鑒定驗證構(gòu)建正確后，提取并純化重組質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS-I細胞，RT-PCR與間接免疫熒光(IFA)鑒定其表達。然后提取并純化轉(zhuǎn)染Mx基因的COS-I細胞裂解液，采用NDV-CEF微量細胞抑制試驗，進一步確定Mx蛋白的抗病毒活性。結(jié)果：對雞Mx基因進行PCR誘變修飾正確，構(gòu)建了能夠正確表達雞Mx蛋白的重組真核表達載體。微量細胞抑制試驗分析結(jié)果顯示，重組

5、Mx蛋白具有較強的抗新城疫病毒生物活性。 3.以酶切線性化的重組質(zhì)粒為目的基因，直接將目的基因通過隨機打點法注射入睪丸，轉(zhuǎn)染SSCs，產(chǎn)生攜帶有目的基因的成熟精子用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞。采用常規(guī)PCR．檢測技術(shù)，在DNA分子水平檢測證實外源基因(Mx)的整合。結(jié)果：PCR檢測證實外源基因(Mx)已整合到精子基因組，且能通過體外受精在后代中穩(wěn)定整合，后代PCR檢測的陽性率為27.27％(6/22)。表明睪丸內(nèi)注射法可能是一種切實可行、